一种活动性SLE的诊断标志物及其应用的制作方法

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种活动性sle的诊断标志物及其应用。

背景技术：

1、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，sle)是一种严重的自身免疫病，常累及多个器官和系统，其主要临床特征是血清中出现多种自身抗体、免疫复合物沉积。sle的异质性非常高，可影响多种组织和器官，关节皮肤黏膜病变是sle最常见的病变，同时也非常容易出现肾脏和神经系统等重要脏器受累，这些严重影响患者预后，造成较高的致残、致死率。即便受累人群以青年女性为主，但15年累计死亡率仍高达20％。此外，由疾病本身造成的治疗花费及劳动能力丧失也给个人、家庭及国家卫生系统带来了沉重的经济负担。

2、sle因其复杂性和异质性为临床诊断带来很大挑战，目前sle在诊断上缺乏敏感特异的生物标志物，误诊率高。早在1982年，人们将抗双链dna(dsdna)抗体作为sle的诊断和病原学标准，其对sle诊断具有较高的特异性(95％)，而敏感性相对较低(52％)。补体c3、c4水平降低，也是sle常见的血清指标，c3和c4同时降低对sle敏感度为45％，特异度范围为88％至96％。此外，尿沉渣、尿蛋白等也广泛应用与狼疮肾病的诊断。但这些诊断标志物大多出现在器官受损、疾病进展到一定程度之后，无法对sle患者进行早期诊断。因此深入研究sle的发病机制，寻找新型有效的诊断标志物和治疗靶点，尤其是疾病早期的诊断标志物，对提高sle的诊疗具有重要意义。

3、异常的免疫调控和自身免疫耐受缺失是sle主要的免疫病理机制之一，固有性和适应性免疫反应失调均参与了疾病的发生发展过程。目前大部分研究都聚焦于b淋巴细胞、t淋巴细胞以及树突状细胞参与系统性红斑狼疮的发病过程。随着研究的深入，人们逐渐发现中性粒细胞参与sle致病，可能在疾病早期出现异常。中性粒细胞是sle患者体内自身抗原的主要来源。在sle患者体内，自身抗体激活中性粒细胞，中性粒细胞释放含有dna和抗菌肽复合物的网，又被称为中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，nets)。不能及时清除的nets成了为了自身核抗原的主要来源。nets释放引起的中性粒细胞死亡称为netosis，是中性粒细胞特有的死亡方式。sle患者的中性粒细胞发生包括netosis、凋亡、铁死亡在内的多种途径细胞死亡异常，导致中性粒细胞数量显著低于健康人群，同时释放大量自身抗原，引起自身免疫反应。而无论细胞发生哪种死亡方式，ros的大量产生都是一个不可缺少的的必要条件。中性粒细胞在激活后的最主要特征之一就是强大的氧爆发，在此期间大量的氧被消耗并转化为ros。

4、在维持中性粒细胞ros稳态平衡的过程中，细胞内氧化还原系统发挥直接调控作用，另一方面细胞还可以通过免疫抑制性受体负调ros相关信号通路抑制其产生。免疫抑制性受体的共同特点是在其胞内段含有一个或多个保守的免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif,itim)，在免疫抑制型受体与配体结合后可以通过itim磷酸化，募集下游的磷酸酶如shp1和shp2发挥免疫抑制效应。含v-set和跨膜结构域蛋白1(v-set and transmembrane domain containing 1，vstm1)是一种新型免疫抑制受体，胞内存在两个免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)，可以募集磷酸酶shp-1传递抑制信号。vstm1是一个新的与免疫调节相关的编码基因。该基因定位于染色体19q13.42，由11个外显子和10个内含子组成，存在5种剪切体，分别为vstm1-v1，v2，v3，v4，v5，其中v1、v2是最主要的剪切形式。vstm1-v1有236个氨基酸，是i型跨膜蛋白，胞内有2个itim基序，是一个新型免疫抑制型受体。研究表明vstm1激活抗体可以通过抑制mek-erk信号通路抑制吞噬细胞fc受体介导的ros产生，并抑制sle中性粒细胞自发、抗体刺激或尿酸钠结晶刺激引起的nets形成。但vstm1与sle疾病发生是否有直接关系，又通过什么机制参与sle发病目前并不清楚。vstm1在生理状态下的配体并不清楚，寻找其生理性配体，对于明确vstm1在体内发挥生理功能的机制至关重要。我们的研究首次发现了血清中的半乳糖凝集素galectin-1是其生理性配体。galectin-1是半乳糖凝集素家族中的成员，具有识别并结合β半乳糖的糖识别结构域，参与包括细胞黏附、凋亡、免疫应答等多种生理病理过程。

5、细胞氧化稳态平衡在包括sle在内的多种疾病中发挥重要作用，但是由于细胞氧化状态难以测量和评估，因此至今没有研发出氧化还原相关物质作为疾病标志物。通过对调控细胞ros的受配体对在sle发病机制中的研究，不仅能加深我们对疾病的了解，而且在研发新型诊断标志物方面也具有重要的临床意义。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供一种活动性sle的诊断标志物及其应用。

2、本发明首先提供抗v-set和跨膜结构域蛋白1，即vstm1抗体和/抗galectin-1抗体在制备用于诊断活动性sle患者的试剂中的用途。

3、在本发明一个具体实施方案中，所述诊断包括通过酶联免疫反应测定获自呈现活动性sle的生物样品中vstm-1水平；与对照数据比较所述生物样品中vstm-1的水平，其中，相对于所述对照数据，所述样品中vstm-1显著降低表明患活动性sle的可能性。

4、在本发明一个具体实施方案中，所述诊断包括：测定获自呈现活动性sle的生物样品中vstm-1与配体galectin-1结合物的水平；与对照数据比较所述生物样品中vstm-1与配体galectin-1结合物的水平，其中，相对于所述对照数据，所述样品中vstm-1与配体galectin-1结合物的显著降低表明患活动性sle的可能性。

5、在本发明一个具体实施方案中，所述诊断包括：测定获自呈现活动性sle的生物样品中还原型galectin-1蛋白的水平；与对照数据比较所述生物样品中还原型galectin-1蛋白的水平，其中，相对于所述对照数据，所述样品中还原型galectin-1蛋白的显著降低表明患活动性sle的可能性。

6、其中，vstm-1与配体galectin-1结合物的水平通过如下步骤测定：

7、将抗vstm1抗体与待测样品的中性粒细胞蛋白孵育，在富集到等量的vstm1蛋白的情况下再与血清蛋白共孵育，用抗galectin-1抗体通过酶联免疫反应检测富集到的galectin-1蛋白含量。

8、其中，还原型galectin-1蛋白的通过如下步骤测定：

9、用生物素(biotin)偶联的3-吲哚乙酰胺(indole-3-acetamide，iam)与血清样本孵育，结合蛋白中的还原型巯基位点，再用链霉亲和素(streptavidin)磁珠富集含有还原型巯基位点的蛋白，用抗galectin-1抗体通过酶联免疫反应检测富集到的还原蛋白中还原型galectin-1蛋白的含量，相对于健康对照数据，血清中还原型galectin-1蛋白显著降低表明患活动性sle的可能性。

10、其中，vstm1的水平通过以下步骤来测量，包括：

11、a.使来自患者的生物样品与所述抗体接触；

12、b.在生物样品中存在的vstm1与所述抗体之间形成抗体-蛋白质复合物；

13、c.洗涤来除去任何未结合的抗体；

14、d.添加被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体；

15、e.洗涤来除去任何未结合的被标记的所述检测抗体；

16、f.将所述检测抗体的标记物转化为可检测信号。

17、其中，所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的标记物来标记。

18、其中，所述生物样品为血清或者外周血中分离的中性粒细胞。

19、其中，抗galectin-1抗体通过酶联免疫反应检测富集到的还原蛋白中还原型galectin-1蛋白的含量、用抗galectin-1抗体通过酶联免疫反应检测富集到的galectin-1蛋白含量的具体方法是本领域熟知的，例如可参考前述利用抗vstm1抗体检测vstm1含量的方法。

20、本发明还提供抗vstm1抗体在检测galectin-1含量中的用途，具体的，将抗vstm1抗体与待测样品的中性粒细胞蛋白孵育，在富集到等量的vstm1蛋白的情况下再与血清蛋白共孵育，用抗galectin-1抗体通过酶联免疫反应检测富集到的galectin-1蛋白含量。

21、本发明还提供一种检测galectin-1含量的方法，包括将抗vstm1抗体与待测样品的中性粒细胞蛋白孵育，在富集到等量的vstm1蛋白的情况下再与血清蛋白共孵育，用抗galectin-1抗体通过酶联免疫反应检测富集到的galectin-1蛋白含量。

22、本发明还提供vstm1基因作在制备用于诊断活动性sle患者的试剂中的用途。

23、其中，所述诊断包括：测定获自呈现活动性sle患者的生物样品中vstm1基因的表达水平；任选地，

24、与对照数据比较所述生物样品中vstm1基因的表达水平，其中，相对于所述对照数据，所述样品中vstm1基因的表达水平可检测的降低表明患活动性sle的可能性。

25、其中，所述生物样品为血清或者外周血中分离的中性粒细胞。

26、其中，vstm1基因的表达水平通过以下步骤来测量：反转录pcr、real-time pcr和/或northern blotting。

27、本发明还提供一种活动性sle的检测试剂盒，其包括对vstm1或galectin-1或其片段为反应性的抗体，或用于扩增vstm1基因的引物对。

28、在本发明实施方案中，所述的引物对为可用于扩增所述基因的所有引物对，可为一对或多对。在一个具体的实施方案中，所述的引物对序列如seq id no.1和seq id no.2所示。

29、本发明证明了在病情活动的sle患者中性粒细胞上，vstm1无论是从mrna的水平，还是蛋白水平的表达量均显著低于健康对照。在sle患者中性粒细胞上与vstm1结合的配体galectin-1蛋白显著低于健康对照，sle患者血清中还原型galectin-1占比也显著低于健康对照，且这种降低与疾病活动度有关，疾病活动度越高，下降程度越严重。这些结果表明，vstm1及其配体还原型galectin-1可作为活动性sle患者的诊断标志物。