一种用于二甲双胍治疗肿瘤的分子标记物及其应用

本发明涉及肿瘤治疗领域，具体涉及一种用于二甲双胍治疗肿瘤的分子标记物及其应用。

背景技术：

1、二甲双胍被认为是治疗代谢性疾病的一线药物。近十年来，有关二甲双胍抗肿瘤作用的研究持续升温。目前，从分子水平上看，二甲双胍可通过调节线粒体电子传递链等多种代谢途径以及ampk和mtor等信号通路发挥抗肿瘤作用。从细胞和动物水平看，它能够改变肿瘤免疫微环境以促进肿瘤细胞的死亡，降低肿瘤细胞的代谢活性，进而抑制肿瘤生长。另外，二甲双胍还可以联合禁食，通过抑制pp2a-gsk3b-mcl-1通路抑制肿瘤生长，与血红素连用，可以靶向治疗三阴性乳腺癌。另外，多项临床试验表明，二甲双胍能降低患者体内的ki-67或其他肿瘤标志物的水平，还能提高化疗患者的生存率，联合表皮生长因子受体(egfr)靶向药物治疗血糖无异常的非小细胞肺癌患者，其生存时间明显改善。这些结果都表明二甲双胍起到了抗肿瘤的作用。但是，也有一些临床实验数据显示，二甲双胍治疗并不能改变ki-67的表达水平，甚至在一项前列腺癌的临床研究中显示，使用二甲双胍后ki-67有所升高(clinicaltrials.gov)；对于原位无法切除的非小细胞肺癌、晚期胰腺癌或转移性胰腺癌患者，使用化疗联合二甲双胍并没有取得更好的临床疗效。此外，二甲双胍长期治疗会引发耐药，在乳腺癌治疗过程中，二甲双胍耐药将引起上皮-间充质转化(emt)的持续激活，降低了乳腺癌细胞对他莫西芬的敏感性。综上，二甲双胍是否能真正应用于肿瘤治疗尚不可断下结论，还需要进一步扩大临床实验的样本量。但就从目前的数据来看，二甲双胍并非人人适用，当务之急是找到适合该药物治疗的肿瘤分子标志物，通过分子分型进行肿瘤的精准治疗。

2、二甲双胍会影响蛋白质的定位、翻译后修饰、活性和基因表达。叉头盒(fox)家族成员是机体对二甲双胍刺激做出反应的主要效应因子。例如，二甲双胍通过对foxo1的调控控制机体血糖稳定并抑制雌激素依赖的子功内膜癌细胞的增殖；同时，二甲双胍通过靶向foxo3a可抑制肝癌的发展。然而，foxo家族成员蛋白是一类经典的抑癌蛋白，在癌细胞中的表达量非常低。因此，用foxo1或foxo3a的表达来界定是否应该使用二甲双胍治疗肿瘤，均不合理，它们都不是理想的生物标志物。

3、叉头盒(fox)家族成员的dna结合域中含有一个同源的叉头结构域，这是一个80-100个氨基酸的序列，因其结构外观类似蝴蝶而被称为翼螺旋。该家族包含50多个成员，参与了一系列病理生理过程，包括细胞增殖、干细胞分化、代谢性疾病和肿瘤发生。2019年，研究人员发现另一个叉头亚科成员foxk(包括foxk1和foxk2)是以前未被发现的胰岛素作用靶点。有趣的是，与foxo的生物功能和分子机制相反，foxk转录因子在胰岛素刺激后会从细胞质转位到细胞核，并在转录调控中发挥抑制作用。更重要的是，相较于foxk2被普遍视为抑癌因子，foxk1则被认为是促进肿瘤发生的癌基因，但其促癌的分子机制及针对二甲双胍对癌症进行治疗干预是否能有预测能力仍有待阐明。

4、研究表明，一系列与昼夜节律相关的基因通过转录-翻译反馈环路呈现出自然振荡的表达周期(接近24小时)。此外，这些基因还能调节一系列生理和行为模式，以应对环境变化，这也被称为昼夜节律。迄今为止，已发现约20个基因参与昼夜节律的发生和维持。其中，clock、bmal1、per1、per2、cry1和cry2被认为是生物钟的核心基因。clock和bmal1形成异源二聚体，可激活下游基因(包括per1、per2、cry1和cry2)的转录。当per和cry转录-翻译蛋白积累到临界水平并与clock/bmal1二聚体形成复合物时，它们自身的转录就会受到抑制，无法继续进行。动物模型和流行病学研究表明，昼夜节律失调与各种癌症的发病率增加有关，大量的数据显示，per/cry通过转录调控、参与细胞dna损伤修复过程及机体代谢等途径发挥肿瘤抑制基因的作用。bmal1和per2的异常突变会导致c-myc基因高表达，从而促进肺癌的发生发展。per2基因缺失的老鼠显示出更强的患瘤倾向性。在晚期神经母细胞瘤中，myc通过抑制bmal1的表达打乱生物钟，促进肿瘤细胞增殖。cry2的突变会抑制tp53的表达进而促进肿瘤细胞增殖。因此，寻找更多的可调控生物节律的因子，进一步阐明时钟基因失调的分子机制对认识肿瘤发生发展具有重要意义。

5、在许多肿瘤中，机体对胰岛素的敏感性会降低，甚至由于肿瘤细胞或副产品代谢异常而出现胰岛素抵抗。此外，与良性肿瘤相比，慢性胰岛素抵抗在侵袭性肿瘤中更为常见。胰岛素敏感性降低会代偿性的使机体胰岛素水平升高。相应地，高胰岛素血症或胰岛素抵抗过程导致的持续高胰岛素血症状态将进一步促进肿瘤的发展。例如，胰岛素抵抗的发生与绝经后乳腺癌患者的侵袭性转移表型和不良预后密切相关。在体外，胰岛素促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而在体内，胰岛素则促进乳腺癌的进展。然而，异常胰岛素刺激促进肿瘤发生发展的具体分子机制还有待阐明。

6、由于二甲双胍可以增强机体对胰岛素的敏感性，且目前临床上，研究二甲双胍作为癌症疗法的后期临床试验正在进行中。从现有的结果看，该药物具备抗肿瘤能力，但临床应用仍然面临很大的挑战：包括部分患者并不能获益，以及该疗法会产生耐药及幅度作用，故而二甲双胍精准应用于肿瘤的治疗尚待新的分子标志物进行分型。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，为解决现有技术存在的问题，重点围绕肿瘤的发病机制，并通过分子分型的鉴定，提供“老药”二甲双胍的应用于肿瘤精准治疗的分子标记物。

2、本发明的用于二甲双胍治疗肿瘤的分子标记物，其特征在于，为核表达的人叉头盒蛋白foxk1或人叉头盒蛋白foxk1的编码基因。

3、根据本发明所述的分子标记物，其中优选的，所述人叉头盒蛋白foxk1的氨基酸序列如seq id no.1

4、(maevgedsgarallalrsapcspvlcaaaaaaafpaaapppapaqpqpppgpppppppplppgaiagags)所示，或者，人叉头盒蛋白foxk1的氨基酸序列通过氨基酸替换、缺失或者增加而与如seq id no.1所示序列具有85％以上相似性的序列。

5、本发明的分子标记物适用于本领域公知的任意可以使用二甲双胍治疗的肿瘤，尤其优选但不限于的肿瘤为乳腺癌、肾癌、胰腺癌、黑色素瘤、胃癌、肺癌、肝癌和子宫内膜癌中的一种或两种以上。

6、本发明还提供了所述任一分子标记物在制备用于二甲双胍治疗肿瘤过程中的辅助药物或检测产品的应用。

7、根据本发明所述的应用，其中作为一种优选，所述用于二甲双胍治疗肿瘤过程中的检测产品为试剂盒。

8、进一步优选的，所述分子标记物为核表达的人叉头盒蛋白foxk1，所述试剂盒为elisa，免疫组化或荧光抗体试剂盒，试剂盒中包括抗体，所述抗体为核表达的人叉头盒蛋白foxk1的抗体。

9、优选的，试剂盒中抗体浓度不低于0.05μg/ml。进一步优选的，荧光抗体试剂盒中抗体浓度不低于1.0μg/ml。免疫组化试剂盒中抗体浓度不低于5.0μg/ml。elisa试剂盒中抗体浓度不低于0.05μg/ml。

10、根据本发明所述的应用，作为优选的，foxk1的核内单位面积平均累计光密度(iod)在1.4以下，认为foxk1核内低表达或不表达；iod到达2.59及以上，认为foxk1核内高表达。

11、本发明还提供了上述任一所述分子标记物在非疾病诊断与治疗目的的二甲双胍抗肿瘤过程中的应用，尤其是实验室领域的应用，比如科研或商业目的相关实验用途。

12、本发明重点围绕肿瘤的发病机制，并通过分子分型的鉴定，找到“老药”二甲双胍应用于肿瘤精准治疗的分子标记物。本发明从探讨不同肿瘤对二甲双胍刺激的敏感性为切入点，筛选出目的蛋白foxk1，发挥医学与生命科学学科交叉的优势，结合遗传学、分子/细胞生物学、生物信息学及实验动物学等手段，配合免疫组化芯片标本，探究foxk1在肿瘤发生发展中介导的表观遗传调控机制，进而阐明其可作为基于肿瘤病人分子分型的个体化诊疗的合理标志物。即在肿瘤发生发展过程中，肿瘤代谢及副产物使机体对胰岛素敏感性下降，高胰岛素刺激会使foxk1持续入核且表达升高，通过对下游基因转录的表观遗传调控，打乱细胞生物节律，促进肿瘤进一步发生发展。二甲双胍使foxk1部分出核且表达下降，通过恢复生物节律，发挥抗肿瘤作用。本发明的用于二甲双胍治疗肿瘤的分子标记物有助于阐明肿瘤的发病机制，为肿瘤治疗提供新思路和新靶标，同时以foxk1表达为分子分型依据，为临床使用二甲双胍精准治疗肿瘤提供新的分子标记物。

13、本发明获得了二甲双胍可以通过诱导foxk1出核，恢复细胞生物节律，从而发挥抗肿瘤的作用机制。因此，本发明以foxk1的核表达为分子标志物，核内高表达foxk1的肿瘤患者建议予以二甲双胍治疗；核内低表达、不表达患者则不适于二甲双胍治疗。本发明为解决肿瘤患者二甲双胍的精准应用提供创新性思路和靶标。