注射器内分散固相萃取-超高效液相色谱串联质谱同时检测鱼肉中79种兽药及代谢物的方法与流程

本发明属于水产品检测，尤其涉及一种注射器内分散固相萃取-超高效液相色谱串联质谱同时检测鱼肉中79种兽药及代谢物的方法。

背景技术：

1、兽药在水产养殖过程中能够对水产品的病害或损伤起到预防、减轻或者治疗作用，确保水产品的正常生长和产量输出。在集约化、规模化水产养殖基地，生产经营者常使用各种兽药来预防和治理水产生物病害以提高产量效益。但是，由于兽药的不规范使用致使水产品体内产生过量残存的兽药以及兽药代谢物的现象时有发生，长期食用兽药残留超标的水产品会在人体内积蓄，危害人们健康。

2、兽药品种繁多，结构和性质差异较大，目前兽药残留检测方法标准仍然主要以单类别测定为主，且样品前处理过程繁琐，耗时耗力。开发简便、快速、高通量、高灵敏度的多类别兽药残留检测技术是目前所需。

3、水产品基质复杂，蛋白质、脂肪、色素含量较高，如鱼类，因而对样品前处理和仪器分析技术要求均较高。仪器分析方面，uplc-ms/ms技术以其高选择性、高灵敏度、高准确性的优势成为复杂基质中多类别兽药残留检测的首选。样品前处理方面，目前最常用的固相萃取技术(solid phase extraction,spe)，虽然能有效降低基质共提物的干扰，但操作繁琐、耗时耗力且有机溶剂使用量大。因此，在传统spe技术的基础上，分散固相萃取(dispersive solid phase extraction,dspe)技术因其简单、快捷、溶剂消耗量小等优势，在多兽药残留检测领域得到了广泛的应用。但分散固相萃取方法中又存在因反复离心和溶液转移操作，净化时间长，且反复操作可能带来的交叉污染的技术问题。

技术实现思路

1、为了解决以上技术问题，本发明提供一种注射器内分散固相萃取-超高效液相色谱串联质谱同时检测鱼肉中79种兽药及代谢物的方法，利用注射器特有的活塞推拉操作，减少了传统dspe过程中的反复离心和溶液转移操作步骤，简化了样品前处理过程，提高了检测效率，降低了反复操作可能带来的交叉污染，简单、快捷、灵敏度高和准确性好，适用于鱼肉中多种类别的兽药及其代谢物的同时测定。

2、解决以上技术问题的本发明中的一种注射器内分散固相萃取-超高效液相色谱串联质谱同时检测鱼肉中79种兽药及代谢物的方法，其特征在于：包括以下步骤：

3、(1)预备注射器净化装置和标准工作溶液，所述注射器净化装置用于分散固相萃取样品；另称取孔雀石绿和隐色孔雀石绿标准品于量瓶中，用乙腈溶解并定容即得标准储备溶液，与其他77种兽药及代谢物标准溶液混合后即得标准工作溶液；

4、(2)样品预处理：离心器管内加入样品和提取剂混合，再加入无水硫酸钠混合后，超声提取后离心；样品经提取剂提取，无水硫酸钠盐析；

5、(3)样品净化过滤：注射器净化装置内吸入上清液，以净化剂进行净化，经注射器活塞推拉操作一步完成提取液的转移、净化和过滤，得待检测的样品溶液；

6、(4)标准工作溶液和样品溶液测定：将所述步骤(1)中不同浓度的标准工作溶液进行uplc-ms/ms(超高效液相色谱串联质谱)检测并得到标准谱图，根据获得的标准谱图制作标准工作溶液的浓度和色谱峰面积关系曲线图；同时，所述步骤(3)中样品溶液与水混匀，用色谱柱分离，uplc-ms/ms测定，得到样品谱图；

7、(5)鱼肉中79种兽药及代谢物的确定：

8、定性测定确定：在相同实验条件下测定标准溶液和样品溶液，如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时间与标准溶液中的某种组分色谱峰的保留时间偏差在±2.5％以内，且所选择的质谱采集窗口对应的相对离子丰度比与标准溶液进行比较时，相对偏差不超过下表规定的范围，则可判定样品中存在该组分：

9、定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差表

10、 相对离子丰度/％ ＞50 ＞20～50 ＞10～20 ≤10 允许的相对偏差/％ ±20 ±25 ±30 ±50

11、本发明在dspe的基础上，进一步简化了操作，将样品提取液的转移、净化和过滤步骤在注射器内一步完成，以鱼肉为代表基质，结合uplc-ms/ms技术，通过优化色谱质谱参数、提取净化条件等，建立了注射器内分散固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法用于同时测定鱼肉样品中7类79种兽药及其代谢物残留。

12、所述装置包括设有注射器本体，还设有滤头或注射器针头，所述注射器本体设有注射器活塞和空筒，空筒内为中空，注射器活塞一端从空筒顶端伸入空筒内相对于空筒内壁来回移动；空筒内注射器活塞下方设有净化剂层和脱脂棉层，脱脂棉层为2层，第一层脱脂棉设于空筒内底端，第二层脱脂棉位于注射器活塞下方和净化剂层上方，净化剂层位于2层脱脂棉层之间，第二层脱脂棉随着向上吸附力或向下推压力而相对空筒内壁来回移动；所述滤头与注射器针头使用时根据需要进行相互更换使用，使用时注射器针头设于空筒外，与空筒底端连接；滤头设于注射器外及下方位置，与空筒底端连接。

13、所述滤头为0.22μm的ptfe滤膜。

14、操作过程中向上拉动注射器活塞，通过注射器针头吸取经处理后的样品上清液，经第一层脱脂棉层至空筒内的净化剂层形成体积可变化的提取液净化层，第二层脱脂棉因向上吸附力和提取液净化层不断变高的推动，从而随着注射器活塞向上移动；吸附完后，将注射器针头取下更换为滤头，充分振荡后向下缓慢推动注射器活塞，第二层脱脂棉因向下推动力同样向下推压提取液净化层，将样品上清液经第一层脱脂棉推出空筒，再经收集滤液备用。

15、本发明中将dspe净化剂置于注射器内，通过注射器的活塞推拉操作即可一步完成提取液的转移、净化和过滤步骤。采用将脱脂棉压实置于净化剂上下两端的方式保证装置不漏净化剂，操作简便、快速、实用，既提高了检测效率又降低了反复转移溶液带来的交叉污染风险，且避免了吸取提取液更换针头式滤膜时净化剂容易漏出的问题。

16、所述步骤(2)中提取剂与无水硫酸钠质量体积用量比为10：6。具体的小样测试中提取剂可为液体10ml，无水硫酸钠为固体6g。所述提取剂为0.1-1％甲酸乙腈；进步优化方案中提取剂为0.5％甲酸乙腈。

17、所述步骤(2)中超声提取15min，8000r/min离心5min。

18、所述净化剂为c18吸附剂100-400mg，优化方案中c18吸附剂为200mg；或净化剂为无水硫酸镁与c18吸附剂的固体混合物，无水硫酸镁和c18吸附剂体积用量比例为1：1；进一步优化方案中所述无水硫酸镁为200mg，c18吸附剂为200mg。

19、所述步骤(4)中滤液与水质量体积比为1：4。

20、所述色谱条件中洗脱为梯度洗脱，其中流动相为0.1％甲酸乙腈-0.1％甲酸水。用梯度洗脱方式分离各化合物，色谱分离过程的前4.5min采用了非常平缓的洗脱梯度，避免79种化合物中出现5组同分异构体无法实现质谱分离的情况。

21、所述洗脱速率为0.4ml/min。

22、本发明中洗脱梯度非常平缓指的是：前4.5min，弱洗脱的水相(0.1％甲酸水)由95％降低到85％，洗脱梯度变化速率(△b％/min)为2.2％/min。该梯度在uplc分析中属于非常平缓的洗脱梯度。

23、所述步骤(4)中色谱条件具体如下：

24、色谱柱：waters acquity uplc hss t3(50mm×2.1mm 1.8μm)；流动相：a为0.1％甲酸乙腈，b为0.1％甲酸水；流速：0.4ml/min；柱温：40℃；进样量：5μl；梯度洗脱程序：0～4.5min，95％～85％b；4.5～6min，85％～5％b；6～6.5min，5％b；6.5～6.6min，5％～95％b；6.6～8min，95％b。

25、质谱条件如下：

26、离子源：电喷雾离子源(esi)；扫描方式：正离子扫描；监测模式：多反应监测(mrm)；喷雾电压：5500v；气帘气(cur)压力：35psi；雾化气(gs1)压力：50psi；辅助气(gs2)压力：50psi；离子源温度(tem)：550℃。

27、所述7类79种兽药及其代谢物包括喹诺酮类、磺胺类、硝基咪唑类、大环内酯类、苯并咪唑类以及水产品中容易滥用的镇静剂地西泮和禁用杀菌剂孔雀石绿。

28、所述步骤(5)中，定性测定后鱼肉中若有兽药及代谢物组分存在，再定量测定含量，步骤如下：

29、配制基质混合标准工作溶液并进样uplc-ms/ms，以峰面积为纵坐标，目标分析物浓度为横坐标绘制标准曲线，外标法定量，定量结果按如下式计算：

30、

31、式中：

32、xi为试样中被测组分含量，单位为微克每千克(μg/kg)；

33、ci为从标准工作曲线得到的样品溶液中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；

34、v为样品溶液提取体积，此处为50，单位为毫升(ml)；

35、m为样品质量，单位为克(g)。

36、基质混合标准工作溶液配制：以鱼肉空白样品经样品前处理得到基质溶液，逐级稀释混合标准使用溶液，配制成标准系列工作溶液。目标分析物为定性检测到存在的79种兽药及代谢物。

37、本发明中方法引入注射器净化装置，利用注射器特有的活塞推拉操作，减少了传统dspe过程中的反复离心和溶液转移操作步骤，简化了样品前处理过程，可将净化时间缩短至2min以内，提高了检测效率，加标回收率在62.0％-102.6％之间，rsd在1.3％-18.5％之间，重现性良好；同时降低了反复操作可能带来的交叉污染。采用本发明中建立的检测方法对实验室检出的阳性样品进行测定，结果表明该方法与国标方法无显著差异，方法操作更简便、快速，灵敏度高、准确性好，检测通量更高，可用于鱼肉中多类别、多组分的兽药及其代谢物残留量的同时检测，同时测定7类79种兽药及其代谢物残线性关系良好，相关系数均大于0.995。