妥布霉素地塞米松滴眼液中妥布霉素有关物质的检测方法与流程

本技术属于药物分析，尤其是涉及一种妥布霉素地塞米松滴眼液中妥布霉素有关物质的检测方法。

背景技术：

1、妥布霉素地塞米松滴眼液，是一种含有糖皮质激素的抗生素滴眼液，临床主要用于治疗对肾上腺皮质激素有反应的眼科炎性病变及眼部表面的细菌感染或有感染危险的情况；适用于眼脸、球结膜、角膜、眼球前段组织及一些可接受激素潜在危险性的感染性结膜炎等炎性疾病，可以减轻水肿和炎症反应；也适用于慢性前葡萄膜炎、化学性、放射性、灼伤性及异物穿透性角膜病变。其主成分之一妥布霉素为氨基糖苷类广谱抗生素，其生产工艺主要为菌种发酵、吸附、解吸、浓缩、纯化、结晶和包装等。

2、目前，妥布霉素地塞米松滴眼液收录在《中国药典》2020年版二部、《美国药典》2021及进口药品注册标准中。其中，《中国药典》2020年版二部采用蒸发光散射法(elsd)对妥布霉素地塞米松滴眼液中妥布霉素有关物质进行分析，该法流动相体系较简单，洗脱方式为等度洗脱，但相较来说，elsd法灵敏度低、检测范围窄、重现性差，无法很好地对妥布霉素有关物质进行有效分离及定量分析。《美国药典》2021年版未对妥布霉素地塞米松滴眼液中妥布霉素有关物质进行规定；而进口注册标准则采用柱前衍生-紫外检测法进行，此法操作繁琐、重现性差、同时容易引入其他未知杂质。

3、妥布霉素原料药在生产过程和储存过程中容易引入6”-o-氨甲酰妥布霉素、卡那霉素b、新霉胺、2,6-二氨基-2,3,6-脱氧核糖-己糖等多种有关物质。而目前报道的分析方法不能将妥布霉素地塞米松滴眼液中妥布霉素的工艺杂质及降解杂质得到有效分离，同时重现性差会导致检测不准确。因此，开发一种更为适宜的检测方法对于妥布霉素地塞米松滴眼液中妥布霉素有关物质的检测具有实际意义。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本技术提供一种妥布霉素地塞米松滴眼液中妥布霉素有关物质的检测方法，该方法能够对妥布霉素的工艺杂质及降解杂质进行有效分离，进而能够对妥布霉素有关物质进行准确检测，提高了妥布霉素有关物质检测的灵敏度和检测的准确度，对妥布霉素地塞米松滴眼液的质量控制具有重要意义。

2、为此，本技术第一方面提供了一种妥布霉素地塞米松滴眼液中妥布霉素有关物质的检测方法，所述方法采用hplc-cad法进行检测，检测步骤包括：将妥布霉素地塞米松滴眼液作为供试品溶液进样至色谱柱中，然后采用流动相对所述色谱柱进行梯度洗脱，洗脱液进入电喷雾检测器中进行检测，获得检测结果；所述流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为三氟乙酸水溶液，所述流动相b为乙腈；所述妥布霉素有关物质包括妥布霉素、尼伯拉胺、新霉胺、卡那霉素b、6-o-(3-氨基-3-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖)-2-脱氧-d链霉胺和2,6-二氨基-2,3,6-脱氧核糖-己糖中的一种或多种。

3、本技术所述检测方法采用妥布霉素地塞米松滴眼液直接作为供试品溶液，无需对妥布霉素地塞米松滴眼液进行样品处理即可进行进样检测。检测过程中采用特定的流动相对色谱柱中的供试品溶液进行梯度洗脱，使供试品溶液中的妥布霉素有关物质里的工艺杂质和降解产物有效分离，洗脱后的洗脱液可以直接进入到电喷雾检测器中进行检测，若供试品溶液含有妥布霉素有关物质中各被测物，检测后的色谱图会在其相应的保留时间位置出峰，根据峰面积即可计算出各有关物质的含量。本技术所述方法能够对妥布霉素地塞米松滴眼液中妥布霉素有关物质里的工艺杂质和降解产物完全分离并进行准确检测，提高了妥布霉素有关物质检测的灵敏度和准确度，对妥布霉素地塞米松滴眼液的质量控制具有重要意义。同时该方法专属性强、准确度好、精密度高、重复性好，符合药物质量研究标准的技术要求，所得结果稳定可靠。

4、本技术所述方法检测过程中采用的流动相包括特定的流动相a-三氟乙酸水溶液和特定的流动相b-乙腈，采用上述组成的流动相进行梯度洗脱能够对供试品溶液中的妥布霉素有关物质(妥布霉素、尼伯拉胺、新霉胺、卡那霉素b、6-o-(3-氨基-3-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖)-2-脱氧-d链霉胺和2,6-二氨基-2,3,6-脱氧核糖-己糖中的一种或多种)进行有效分离，使检测结果的出峰效果好，进而提高检测结果的准确性和稳定性。

5、本技术中，所述妥布霉素有关物质中妥布霉素、尼伯拉胺、新霉胺、卡那霉素b、6-o-(3-氨基-3-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖)-2-脱氧-d链霉胺和2,6-二氨基-2,3,6-脱氧核糖-己糖的结构式如表1所示。

6、表1

7、

8、

9、在一些实施方式中，所述妥布霉素有关物质包括妥布霉素、尼伯拉胺、新霉胺和卡那霉素b。

10、本技术所述检测方法能够对妥布霉素地塞米松滴眼液中的妥布霉素、尼伯拉胺、新霉胺和卡那霉素b进行有效分离和准确检测，克服了现有分析方法不能将妥布霉素地塞米松滴眼液中妥布霉素的工艺杂质及降解杂质进行有效分离，进而导致检测不准确的问题。

11、在一些实施方式中，所述三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的浓度为0.15～0.25mol/l。

12、在一些优选的实施方式中，所述三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的浓度为0.2mol/l。

13、本技术通过将流动相a-三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的浓度控制在上述范围内，能使采用该流动相a进行梯度时，对被检测物的分离效果更好，有助于进一步提高检测效果。

14、在一些实施方式中，所述流动相进行梯度洗脱的流速为0.3～0.5ml/min；所述梯度洗脱设置如下：

15、0～30min：95～100％a，5～0％b；

16、30～60min：95～100％a，5～0％b→0～5％a，100～95％b；

17、60～65min：0～5％a，100～95％b→95～100％a，5～0％b；

18、65～73min：95～100％a，5～0％b。

19、梯度洗脱的流动相体积百分比组成具体如表2所示。

20、表2

21、

22、在一些优选的实施方式中，所述流动相进行梯度洗脱的流速为0.4ml/min；所述梯度洗脱设置如下：

23、0～30min：100％a，0％b；

24、30～60min：100％a，0％b→0％a，100％b；

25、60～65min：0％a，100％b→100％a，0％b；

26、65～73min：100％a，0％b。

27、梯度洗脱的原理为采用几种不同极性的溶剂形成流动相，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k，并使待测样品中的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。本技术通过采用三氟乙酸水溶液和乙腈作为流动相，在上述梯度洗脱流速和梯度洗脱程序设置条件下，能够使供试品溶液中妥布霉素相关物质的分离效率和分离效果最佳，提升柱效和检测结果的准确性。

28、在一些实施方式中，所述供试品溶液的进样量为8～12μl，进样温度为5～7℃；所述电喷雾检测器的雾化温度为50～55℃。

29、在一些优选的实施方式中，所述供试品溶液的进样量为10μl，进样温度为6℃；所述电喷雾检测器的雾化温度为50℃。

30、本技术采用电喷雾检测器对洗脱液进行检测，具有方法便捷、灵敏度高、重现性好、检测范围更宽等优势。

31、本技术通过选用上述参数设置，能进一步提升妥布霉素相关物质检测的准确性和稳定性。

32、在一些实施方式中，所述色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶颗粒，柱温为25～35℃。

33、在一些优选的实施方式中，所述色谱柱的柱温为30℃。

34、本技术中，所述十八烷基硅烷键合硅胶颗粒的粒径可以为1～10μm，优选为5μm。

35、本技术通过选用上述填充剂和柱温，有助于进一步提升妥布霉素相关物质的分离效率和分离效果。

36、在一些实施方式中，所述色谱柱为zorbax sb-c18，色谱柱规格为250mm×4.6mm、直径为5μm。

37、在一些实施方式中，所述方法还包括如下步骤：配制含妥布霉素有关物质的系统适用性溶液，对所述系统适用性溶液进行进样检测，确定所述妥布霉素有关物质中各被测物的保留时间。

38、本技术对系统适用性溶液进行进样检测的步骤和参数同供试品溶液。本技术中所述系统适用性溶液中含有特定含量的妥布霉素有关物质。在一些实施方式中，所述系统适用性溶液中含有2～3mg/ml的妥布霉素、40～45μg/ml的尼伯拉胺、25～30μg/ml的卡那霉素b和25～30μg/ml的新霉胺。在一些具体的实施方式中，所述系统适用性溶液中含有3mg/ml的妥布霉素、45μg/ml的尼伯拉胺、30μg/ml的卡那霉素b和30μg/ml的新霉胺。

39、本技术通过对系统适用性溶液进行检测，根据系统适用性溶液的色谱图检测结果，可以确定出在该检测条件下妥布霉素、尼伯拉胺、卡那霉素b和新霉胺的保留时间，进而在后续检测中根据相应的保留时间即可确定在该保留时间下所出现的峰为何种被测物。

40、在一些实施方式中，所述方法还包括以下步骤：配制系列浓度的含妥布霉素有关物质的线性对照溶液，对所述线性对照溶液分别进行进样检测；根据所确定的各被测物的保留时间，获取所述线性对照溶液中各被测物的峰面积，进而建立妥布霉素有关物质中各被测物浓度与峰面积的标准曲线，以对供试品溶液中妥布霉素有关物质进行定量检测。

41、本技术中，对线性对照溶液进行进样检测的步骤和参数同供试品溶液。在一些实施方式中，所述线性对照溶液中含有特定浓度的妥布霉素、尼伯拉胺、卡那霉素b和新霉胺。在一些具体实施方式中，系列浓度的含妥布霉素有关物质的线性对照溶液包括：含600μg/ml的妥布霉素、450μg/ml的尼伯拉胺、300μg/ml的卡那霉素b和300μg/ml的新霉胺的线性对照溶液1，含60μg/ml的妥布霉素、45μg/ml的尼伯拉胺、30μg/ml的卡那霉素b和30μg/ml的新霉胺的线性对照溶液2，含6μg/ml的妥布霉素、4.5μg/ml的尼伯拉胺、3μg/ml的卡那霉素b和3μg/ml的新霉胺的线性对照溶液3，和含1μg/ml的妥布霉素、0.9μg/ml的尼伯拉胺、0.5μg/ml的卡那霉素b和0.5μg/ml的新霉胺的线性对照溶液4。

42、本技术通过对上述线性对照溶液进行检测，能够分别建立线性关系良好的妥布霉素度-峰面积的标准曲线、尼伯拉胺-峰面积的标准曲线、卡那霉素b-峰面积的标准曲线和新霉胺度-峰面积的标准曲线。根据所建立的标准曲线，以及对供试品溶液检测后各被测物(妥布霉素、尼伯拉胺、卡那霉素b和新霉胺)的峰面积，即可对供试品溶液中妥布霉素有关物质进行定量检测。

43、本技术的有益技术效果为：本技术所提供的妥布霉素地塞米松滴眼液中妥布霉素有关物质的检测方法，能够对妥布霉素的工艺杂质及降解杂质进行有效分离，具有高灵敏度、分离度的特点，且重复性、耐用性良好，进而能够对滴眼液中妥布霉素有关物质进行准确检测，对妥布霉素地塞米松滴眼液的质量控制具有重要意义。同时该方法专属性强、准确度好、精密度高、重复性好，符合药物质量研究标准的技术要求，所得结果稳定可靠，具有更好的实用价值。