一种快速定量检测猪肺炎支原体特异性SIgA抗体的方法与流程

本发明属于生物检测，具体涉及一种快速定量检测猪肺炎支原体特异性siga抗体的方法。

背景技术：

1、猪气喘病(mps)是由猪肺炎支原体(mhp)引起的一种慢性、接触性传染病。经呼吸道感染后引起呼吸道纤毛的萎缩、损坏、脱落，进而降低了呼吸道粘膜的免疫功能，引起肺部功能性的损伤。该病虽然不造成急性大面积死亡，但发病率较高，猪只一旦感染该病后即会出现喘气、咳嗽等症状，严重影响着猪群的生长发育，造成生长发育迟缓及饲料转化率低等。在当前非洲猪瘟疫情的影响下，该病的发生严重制约着猪的出栏率及饲料回报率。因此，一旦发生该病将给猪场造成严重的经济损失。

2、研究表明，对mps的预防主要通过呼吸道局部的细胞免疫和粘膜免疫。分泌型iga(siga)是参与粘膜免疫反应的主要效应因子，是机体免疫系统中的重要组成部分，在免疫应答中起着重要作用。抗猪肺炎支原体siga是mhp感染和免疫后首先产生的特异性标志，同时也能更好的反映出猪群免疫猪肺炎支原体疫苗后的免疫效果。因此猪群的感染情况可以通过抗体水平的情况得到更好的评定。

3、目前，对于猪支原体肺炎抗体的检测方法主要是：针对血清中特异性igg、鼻拭子中特异性iga抗体的elisa检测方法，这些检测结果的评定需要依赖于临床猪群的免疫及健康情况，通常依据猪群有无免疫过猪肺炎支原体相关疫苗、有无出现类似于猪气喘病症状，以及通过解剖分析肺部变化来进行判定。判定标准存在一定的主观性，且成本要求较高。中国兽医药品监察所建立的微量间接血凝试验(iha)尽管在国内应用比较多，但iha的检测中存在着检测滴度低、结果与感染的相关性低、凝集终点判定的主观性强以及本身固有的技术缺陷等问题。虽然补体结合试验阳性情况与猪肺部病变具有很好的相关性，但会出现较高的假阳性和假阴性。免疫荧光技术也存在着用时较长、灵敏度较低、仪器设备以及操作要求相对较高等缺陷。因此，建立一种能够全面反映免疫或感染猪群猪肺炎支原体抗体保护水平的可靠标准十分必要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种快速定量检测猪肺炎支原体特异性siga抗体的方法。

2、猪肺炎支原体属于兼性厌氧菌，通过消耗葡萄糖产生乳酸或者二氧化碳和水，导致猪肺炎支原体培养基中酚红指示剂发生颜色变化。葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸(dns)在碱性加热条件下，被还原成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，该物质在od540nm处有最大的吸光度。正常情况下，猪肺炎支原体在培养过程中因为葡萄糖消耗量的变化，导致培养基中ph值的发生改变，进而出现颜色反应。当猪肺炎支原体特异性siga抗体与猪肺炎支原体结合后，能够消耗葡萄糖的猪肺炎支原体减少。因此，可依据棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸在od540nm吸光值的变化进行培养基中剩余葡萄糖的测定，进而可以计算出猪肺炎支原体特异性siga抗体结合猪肺炎支原体后培养基中未消耗的葡萄糖的量。通过od540nm变化可以间接测定出猪肺炎支原体特异性siga抗体的含量变化。为了进一步确定特异性siga抗体的含量，本发明依据已知浓度特异性siga抗体与猪肺炎支原体结合后培养基中不同od540nm值制作曲线，即可根据待检样本中od540nm值，计算出待检样本中特异性siga抗体的浓度。因此，可以通过测定猪肺炎支原体培养基中剩余葡萄糖的量的方法，间接对猪肺炎支原体特异性siga抗体进行定量检测。

3、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

4、一种快速定量检测猪肺炎支原体特异性siga抗体的方法，包括以下步骤：

5、1)猪肺炎支原体培养物制备

6、将经过复苏、培养至对数生长期且效价达到108ccu/ml的新鲜的猪肺炎支原体按照20％的接种比例接种于培养基中，得到猪肺炎支原体培养物。

7、2)特异性siga抗体阴阳性对照的制备及标定

8、2-1)特异性siga抗体阳性对照的制备：选取经猪肺炎支原体抗体和抗原检测均为阴性的25～30日龄仔猪，对猪只进行猪肺炎支原体活疫苗(168株)免疫，1头份/只，2周后加强免疫1次，2头份/只，加强免疫后4～6周采集肺泡进行特异性siga抗体的制备，收获的液体经500g离心10min后，16260g离心30min，收获的上清经无菌处理后即为猪肺炎支原体特异性siga抗体阳性对照；

9、2-2)特异性siga抗体阴性对照的制备：经猪肺炎支原体抗原和抗体检测均为阴性25～30日龄仔猪，取其肺进行肺泡液的灌洗、收集，500g离心10min，16260g离心30min，收获的上清液经无菌处理后即为猪肺炎支原体特异性siga抗体阴性对照；

10、2-3)特异性siga的含量标定；采用已知浓度的siga对阳性对照品中siga的含量进行标定；

11、2-3-1)猪源sc重组蛋白的制备

12、从genbank中获取猪源sc基因序列，经过密码子偏好性优化后，合成并插入到pet32a表达载体中；挑选经序列测定阅读框编码正确的单菌落接种到5ml菌液中，180-190r/min 37℃过夜培养，次日按照1:100的比例进行大量培养，37℃、210r/min培养3h后，加入终浓度为0.2mmol/l的iptg，诱导5h后收菌，16260g离心20min，弃上清，沉淀用预冷的pbs洗涤2次，16260g离心15min，弃上清后，将沉淀用超声破碎仪破碎处理(300w)，超3s停5s，超声处理20min～30min，将残留的沉淀采用2mol/l脲洗涤2次，16260g离心15min，弃除上清，沉淀用8mol/l脲4℃过夜溶解后，离心处理，16260g离心15min，弃除沉淀，将上清液进行镍柱、离子交换等进行纯化，获取纯化的猪源sc重组蛋白；

13、2-3-2)特异性siga抗体阳性对照含量的标定

14、因sc蛋白是siga的特异性组成成分(siga是由2个iga和j链、sc分泌片组成)，将猪源sc重组蛋白进行浓度测定后，包被于elisa酶标板中，2μg/孔，37℃孵育2h，pbst洗涤，拍干；2％bsa封闭2h；pbst洗涤，拍干，加入1:5～1：20倍稀释的特异性siga抗体阳性对照和已知浓度的siga样品，37℃孵育45min，pbst洗涤后，加入1：2000倍稀释的羊抗猪iga-hrp(辣根过氧化物酶标记的iga抗体)抗体，tmb底物显色液显色后，2mol/l的h2so4终止，进行od450nm测定，以已知浓度的siga抗体浓度为横纵标，以450nm吸光值为纵坐标，绘制特异性siga标准曲线图，根据已知siga的浓度计算出特异性siga抗体阳性对照的浓度，随后对特异性siga进行稀释，选择线性关系较好的特异性siga抗体浓度区间进行样本中抗体浓度的测定(r2>0.98)。该步骤的设定主要目的：1、测定特异性siga抗体阳性对照的浓度；2.确定不同浓度的特异性siga抗体阳性对照与猪肺炎支原体结合后，能够形成较好相关性的特异性siga抗体的浓度区间，以便确定后期测定过程中特异性siga抗体浓度的选择，即用于确定特异性siga抗体阳性不同稀释度的有效标定点。

15、3)猪肺炎支原体抗体检测步骤：

16、3-1)取1:10倍稀释的猪肺炎支原体培养物和无菌处理的待检样本，等比例混合后，37℃条件下，继续培养48h，同时,取另外3组猪肺炎支原体培养物，分别等比例加入已知不同浓度的特异性siga抗体阳性对照、阴性对照和pbs空白对照，37℃条件下，培养48h，按照步骤3-2)进行培养物中od540nm吸光度的测定；

17、3-2)培养结束后，分别向培养物中继续加入0.5ml dns，充分混匀后，置沸水中加热煮10～12min，立即置冷水中处理，室温放置5～10min，加入2～5ml的纯化水，混匀后，540nm波长下测定吸光度，分别得到不同浓度的特异性siga抗体阳性对照存在条件下培养物中od540nm值(postive，p)、阴性对照存在条件下培养物中od540nm值(negative，n)、pbs空白对照存在条件下培养物中od540nm值(control，c)，以及待测样本存在条件下培养物中的od540nm值(sample，s)；

18、3-3)以特异性siga抗体阳性对照的浓度为横坐标，以不同浓度特异性siga抗体存在下，猪肺炎支原体培养物中od540nm值为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线方程和待检样本od540nm值，计算出待检样本中特异性siga抗体的浓度。

19、本发明具有如下优势：

20、1、本发明方法将中和试验和葡萄糖的测定方法有效的结合在一起，依据一定滴度的猪肺炎支原体在相应时间的培养后，在酚红指示剂的作用下，猪肺炎支原体培养物的颜色发生变化，从而可以直观的对培养基中猪肺炎支原体的增殖情况做出判定，提升了判定结果的可靠性，再通过已知浓度的特异性siga抗体与猪肺炎支原体培养物结合后，测定培养物中od540nm值和待测样本中的od540nm值，即可对待检样本中的特异性siga抗体含量做出准确测定。

21、2、猪肺炎支原体培养技术，主要关键点在于培养基的配制环节，无论是哪一种培养基都需要一定比例的葡萄糖，为支原体的生长提供营养支持。本发明主要借助于猪肺炎支原体在培养过程中会消耗葡萄糖的原理。当猪肺炎支原体与特异性siga抗体结合后，导致猪肺炎支原体消耗葡萄糖的量减少，进而引起猪肺炎支原体培养物中剩余葡萄糖的量增加，即od540nm值增加。当猪肺炎支原体与特异性siga抗体结合越少时，猪肺炎支原体消耗葡萄糖的量增加，其培养物中od540nm值越小。即可通过od540吸光度的变化判定出样本中特异性siga抗体含量的变化，实现了猪肺炎支原体抗体测定的可视化、高效、易操作。

22、3、采用本发明方法，不仅可以快速的实现猪肺炎支原体抗体定量检测，还可以通过已知抗体浓度去测定猪肺炎支原体培养物的滴度，实现了抗原滴度测定的高通量，节约时间，大大提高了检验效率、降低检验时间。

23、4、本发明依据猪肺炎支原体与特异性siga抗体进行中和后，不再消耗葡萄糖的原理，依据培养物中颜色的变化，能够对猪肺炎支原体增殖情况进行可视化监测，同时结合葡萄糖与dns的作用原理，通过测定培养物中od540nm值，提高了实验结果的可信度，同时又能对待检样本中特异性siga抗体的含量进行准确定量。

24、4、本发明方法与iha、补体结合试验、elisa方法相比，受主观因素影响较小、易于排除假阳性和假阴性的问题；

25、5、该检测方法与中和试验和elisa方法相比，不仅大大缩短中和试验的作用时间，而且实现了根据实验结果即可快速确定猪群免疫或感染猪肺炎支原体后的保护水平情况，为该疫病的防控提供切实有力的依据。

26、6、采用本发明方法在进行免疫评估时，不会受到猪群有无免疫过猪肺炎支原体疫苗、有无出现类似于猪气喘病症状，以及病理剖检肺部变化等临床背景的影响。猪肺炎支原体与特异性siga抗体结合后，培养物中od540nm值增大，通过“抗原-抗体”反应，可直观的对猪群的免疫情况及防控措施做出判定。