基于水凝胶微球SERS基底的微流控传感器制备方法及应用

本发明属于微纳传感与微流控，具体的说，本发明涉一种基于水凝胶微球sers基底的微流控传感器制备方法及应用。

背景技术：

1、拉曼散射效应是于1928年c.v.拉曼在实验中发现的，实验时当光穿过透明介质时，一部分散射光具有与入射光不相同的频率。拉曼光谱的理论解释是，入射光子与介质中的分子发生了非弹性碰撞，当分子吸收的光子频率大于散射出去的光子频率时，此时的散射被称为斯托克斯散射，也叫做拉曼散射。但拉曼散射的能量很小，一般情况下难以进行数据的捕获。1977年，van duyne和creighton两个研究组各自独立地发现，吸附在粗糙银电极表面的每个吡啶分子的拉曼信号要比溶液中单个吡啶分子的拉曼信号大约强106，指出这是一种与粗糙表面相关的表面增强效应，被称为sers效应。

2、微流控(microfluidics)是使用微米尺度的微通道处理或操纵流体或液滴的系统所涉及的科学和技术。微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。微流控芯片作为一种新式的生物传感器工具，能够用以加工处理满足多种研究领域的需求。将制备的优异的sers基底集成到微流控芯片中，既能够满足痕量检测的用量问题，又能够发挥拉曼增强基底的检测灵敏性与有效性，具有较高的应用价值。

3、肿瘤标志物又称肿瘤标记物，是指特征性存在于恶性肿瘤细胞，或由恶性肿瘤细胞异常产生的物质，或是宿主对肿瘤的刺激反应而产生的物质，并能反映肿瘤发生、发展，监测肿瘤对治疗反应的一类物质。肿瘤标志物存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中，能够用免疫学、生物学及化学的方法检测到。肿瘤标志物非常之多，单个标记物的敏感性或特异性往往偏低，不能满足临床要求，理论上和实践上都提倡一次同时测定多种标志物，以提高敏感性和特异性。能够快速高灵敏的检测样本中肿瘤标志物的浓度对癌症的早期精准筛查至关重要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决传统检测装置只能检测单一肿瘤标志物导致疾病诊断结果不准确的问题，提供一种基于微球sers基底的集成式微流控传感器的制备方法及其在双肿瘤标志物检测用于早期肝癌精准筛查中的应用。

2、为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：

3、一种基于水凝胶微球sers基底的微流控传感器制备方法，包括以下步骤；

4、步骤s1，制备微球sers基底；

5、通过微流控芯片得到尺寸均一均匀分散的水凝胶微液滴，经过紫外光固化过程液滴交联得到水凝胶微球，采用刻蚀的方法对微球进行表面改性，随后经过表面原位生长金纳米颗粒的过程得到水凝胶微球sers基底；

6、所述的步骤s1具体为：

7、步骤s11，水凝胶微液滴的制备；

8、一个微流控芯片用于制备微液滴，采用油包水的方法制备微液滴，芯片包括三个进液口和一个出口，将pegda、光引发剂水相和油相分别从芯片的进液口注入，油相是添加表面活性剂span80的十六烷，水相是pegda(聚乙二醇二丙烯酸酯)水溶液和光引发剂omnirad 2959水溶液；调节水相与油相的流速比，等液滴生成稳定之后，在出液口收集均匀分散的水凝胶微液滴分散液；

9、所述的水相与油相的流速比具体为：油相流速是9μl/min，水相的流速是1μl/min；

10、步骤s12，水凝胶微液滴的光固化；

11、将步骤s11利用微流控芯片制备的pegda水凝胶微液滴分散液收集在离心管中，由于光引发剂的存在，置于365nm波长的紫外灯下照射进行固化交联得到水凝胶微球，这时水凝胶表面十分光滑，不直接在水凝胶微球表面原位合成金纳米颗粒的原因有两点，光滑的表面可以提供金种子附着的比表面积较小，其次是因为没有微纳结构，sers增强效果不佳。

12、光固化时间为10min；光固化完成后，将水凝胶微球离心，洗涤重新悬浮以去除杂质；

13、步骤s13，水凝胶微球湿法刻蚀；

14、取200μl步骤s12的水凝胶微球悬浮液加入到离心管中，我们采用碱性腐蚀液对其进行刻蚀，向微球悬浮液中加入1ml浓度为2％(w/w)的氢氧化钠溶液进行湿法刻蚀，由于pegda在水中会发生水解反应生成丙烯酸，生成的丙烯酸与氢氧化钠发生反应，从而使得刻蚀可以一直进行下去；通过优化刻蚀时间来控制水凝胶微球表面形貌；随着刻蚀时间的变化，微球表面的形貌也会发生变化，为了优化水凝胶微球表面形貌，将刻蚀时间梯度设为6h、12、18h、24h；

15、步骤s14，水凝胶微球表面金纳米颗粒原位生长；

16、将刻蚀完的微球2000rpm离心，洗涤去除未反应完的氢氧化钠，然后再将其放在离心管中，加入200μl质量分数1％的haucl4溶液和200μl质量分数1％的柠檬酸钠溶液，震荡5分钟，再将离心管放在烧杯中300rpm磁力搅拌100℃水浴加热10分钟，冷却之后离心洗涤得到水凝胶sers微球。

17、步骤s2，微流控芯片的制备；

18、将su8-3035光刻胶通过匀胶机铺满在整个硅片上，在紫外光刻机的光引发交联作用下，将菲林板上具有通道结构的图案刻印在硅基板上；

19、再将聚二甲基硅氧烷(pdms)与固化剂以10:1的比例混合搅拌，抽除内部的气泡后在硅基板上加热倒模形成微流控芯片；

20、所述的步骤s2得到的微流控芯片通道的高度是80μm，芯片整体的长是4.1cm，宽1.2cm。

21、步骤s3，金纳米颗粒的制备及功能化；

22、根据柠檬酸盐还原法，制备出直径40nm左右的稳定金纳米颗粒；

23、在金纳米颗粒表面分别修饰两种不同的拉曼报告分子来间接检测两种肿瘤标志物的浓度(甲胎蛋白(afp)-dtdc，α-l-岩藻糖苷酶(afu)-mgitc)；

24、为了让sers标签能够特异性与两种肿瘤标志物特异性结合，在sers标签上修饰上各自对应的特异性检测抗体；

25、所述的步骤s3具体为：

26、根据柠檬酸盐还原法，将500μl的1％(w/w)haucl4溶解于49ml蒸馏水中，剧烈搅拌加热，煮沸后加入500μl的1％(w/w)haucl4柠檬酸钠，然后搅拌持续加热1h，自然冷却至室温；

27、功能化的sers探针，将检测抗体偶联到金纳米颗粒表面，检测抗体可以特异性的与抗原结合在金纳米颗粒表面。

28、所述的修饰两种不同的拉曼报告分子来间接检测两种肿瘤标志物的浓度(甲胎蛋白(afp)

29、-dtdc，α-l-岩藻糖苷酶(afu)-mgitc)，两种用来指示肿瘤标志物的sers探针的特征峰被标出，具体步骤为：

30、首先取1ml金溶胶，向其中加入的拉曼报告分子溶液，震荡半小时；

31、加入100μl硼酸缓冲液和10μl检测抗体，接着震荡两小时；

32、最后向离心管中加入20μl牛血清白蛋白(bsa)溶液，放置4℃保存一小时。

33、步骤s4，酶联免疫吸附；

34、为形成酶联免疫三明治夹芯结构，对微球首先用去离子水和四氢呋喃分别进行清洗，之后将基底浸泡在含浓度为1mm的11-mua和6-mch的四氢呋喃溶液中24小时；

35、捕获抗体修饰；

36、将功能化的微球sers基底通入芯片，将抗原通过注射泵注入芯片，抗原特异性的与微球表面的捕获抗体结合；最后通入sers探针，探针上的检测抗体再与被捕获住的抗体结合，至此，三明治免疫复合物形成。

37、步骤s5，微流控芯片上双肿瘤标志物的并行sers检测；

38、经过步骤s4的酶联免疫吸附，得到三明治夹芯结构复合物，将芯片置于雷尼绍拉曼测试样品台上，对并行通道中的sers微球进行sers检测并收集结果；光谱仪的参数设置：激发光源为633nm，50×显微镜物镜(0.5na)，激光功率在2.5～5mw，积分时间为10s，积分次数为3次；

39、拉曼mapping所采用的的参数设置是激发光源为633nm，激光功率在2.5～5mw，积分时间为1s，积分次数为1次，采集了19×19(1pixel≈3μm×3μm)个点。

40、本发明还提供了一种基于水凝胶微球sers基底的微流控传感器在双肿瘤标志物的快速超灵敏检测的应用。

41、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

42、1.设计的集成式sers微流控传感器可以并行检测两种肿瘤标志物，提高了疾病检测敏感性和特异性。

43、2.设计的微流控传感器采用间接检测的方式，两种肿瘤标志物均可达到较低的检测限，且均低于临床诊断指标的阈值。