一种同时检测多细菌的多模式组合纳米探针及制备方法

本发明属于生物探针，具体涉及一种同时检测多细菌的多模式组合纳米探针及制备方法与食源性致病菌检测的应用。

背景技术：

1、随着食品安全问题逐渐引起人们的重视，特别是食源性致病菌污染造成的有害物质累积，误食此类被污染的食品极易发生各种中毒现象。

2、现有技术中，为了应对食品中细菌污染的问题，通常采用的检测细菌的方法有平板计数法、多重pcr技术，但上述技术检测细菌存在耗时和假阳性等缺点。为了克服以上缺点，可以利用多重免疫反应进行高效检测，多重免疫反应是一种利用两种及以上的抗原(或抗体)与相应的抗体(或抗原)发生特异性反应并结合底物变化产生的可读信号的检测方法，在一次运行中同时识别不同的目标，达到同时对多种目标定性定量的目的。通过给抗原或抗体连接不同的信号标记(放射性同位素、荧光染料和酶)可以建立多种分析方法，如：放射免疫分析、荧光免疫分析和酶免疫分析。

3、然而，当对多目标进行同时检测时，由于在检测过程中上述免疫分析法均存在检测信号类型单一的问题，这不可避免地会产生信号干扰，且抗体对具有相同或相似决定基的不同抗原发生交叉反应，导致检测的准确性差，甚至产生假阳性结果。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的是提出一种同时检测多细菌的多模式组合纳米探针的制备方法，以解决当下同一环境中多种检测信号同时输出时产生交叉干扰的问题，提高检测的准确性。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的目的之一是提供一种多模式组合纳米探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

4、(1)将咪唑-2-甲醛和聚乙烯吡咯烷酮进行超声溶解，并加入hrp，充分搅拌后，向混合溶液中加入zn(no3)2·6h2o溶液进行反应，然后将反应混合物进行离心、洗涤，得到hrp@zif-90纳米结构；

5、(2)将咪唑-2-甲醛和聚乙烯吡咯烷酮进行超声溶解，并加入inv，充分搅拌后，向混合溶液中加入zn(no3)2·6h2o溶液进行反应，然后将反应混合物进行离心、洗涤，得到inv@zif-90纳米结构；

6、(3)在hrp@zif-90纳米结构中加入pigg进行孵育，反应后进行离心、洗涤以收集产物，得到hrp@zif-90-pigg；在inv@zif-90纳米结构中加入aptamer进行孵育，反应后进行离心以收集产物，得到inv@zif-90-aptamer；

7、(4)将所得到的hrp@zif-90-pigg和inv@zif-90-aptamer按1：1比例混合，即可得到同时检测多细菌的多模式组合纳米探针。

8、优选地，上述一种多模式组合纳米探针的制备方法，步骤(1)中，将咪唑-2-甲醛0.048g和聚乙烯吡咯烷酮0.05g在水溶液2.5ml中超声溶解，并加入40μl的30mg/ml hrp，充分搅拌15min后，向混合溶液中加入zn(no3)2·6h2o溶液(0.00248g zn(no3)2·6h2o溶于2.5ml叔丁醇溶液)进行反应，充分搅拌10min，然后将反应混合物在12000r/min离心5min，并洗涤三次，将得到的反应混合物分散在500μl的超纯水中，得到hrp@zif-90纳米结构。

9、优选地，上述一种多模式组合纳米探针的制备方法，步骤(2)中，将咪唑-2-甲醛0.048g和聚乙烯吡咯烷酮0.05g在水溶液2.5ml中超声溶解，并加入40μl的30mg/ml inv，充分搅拌15min后，向混合溶液中加入zn(no3)2·6h2o溶液(0.00248g zn(no3)2·6h2o溶于2.5ml叔丁醇溶液)进行反应，充分搅拌10min，然后将反应混合物进行离心(12000r/min，3min)，并洗涤三次，将得到的反应混合物分散在500μl的超纯水中，得到inv@zif-90纳米结构。

10、优选地，上述一种多模式组合纳米探针的制备方法，步骤(3)中，在500μl的5mg/mlhrp@zif-90纳米结构中加入10μl的10mg/ml pigg进行孵育24小时，反应后进行离心(12000r/min，3min)，并洗涤三次，将得到的反应混合物分散在500μl的超纯水中，得到hrp@zif-90-pigg；在500μl的5mg/ml inv@zif-90纳米结构中加入50μl 100μm的适配体进行孵育24小时，反应后进行离心(12000r/min，3min)，并洗涤三次，将得到的反应混合物分散在500μl的超纯水中，得到inv@zif-90-aptamer。

11、综上，本发明提出了一种多模式组合纳米探针的制备方法，所述多模式组合纳米探针的制备原理是将两种标记物hrp和inv分别加入咪唑-2-甲醛和聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液中再向上述溶液中分别加入zn(no3)2·6h2o溶液，从而使hrp和inv分别封装于金属有机框架zif-90中，并通过孵育手段共价连接相应的识别元件pigg和aptamer形成标记抗体。将hrp和inv分别包埋于zif-90中一方面可以保护酶的活性，避免由于外界环境影响酶活性导致检测准确度降低的问题。另一方面，zif-90表面含有丰富的基团，能增强标记物与金黄色葡萄球菌的分子识别剂猪免疫球蛋白(pigg)和大肠杆菌适配体偶联。

12、本发明的目的之二是提供一种经过上述制备方法制备后得到的同时检测多细菌的多模式组合纳米探针。本发明利用多重免疫分析与互不干扰的双模式信号相结合，每种信号的依赖性底物不同以及易于差分测量等特点，避免了同一环境中多种检测信号同时输出时产生交叉干扰的问题，提高检测的准确性。

13、本发明的目的之三是提供一种上述的检测多细菌的多模式组合纳米探针在同时对食品中多种细菌进行检测的应用。

14、上述技术方案中，所述的检测多细菌的多模式组合纳米探针在同时对食品中多种细菌进行检测时，包括以下步骤：

15、(1)将cpba-fe3o4引入含有e.coli和s.aureus的hepes缓冲液中，进行孵育，反应后进行磁分离、洗涤，得到多种细菌共轭物；

16、(2)在得到的共轭物(cpba-fe3o4-e.coli和cpba-fe3o4-s.aureus)中加入同时检测多细菌的多模式组合纳米探针进行孵育，反应后分离多余的多模式组合纳米探针，即可得组合探针与食源性致病菌的复合物；

17、(3)在组合探针与多细菌的复合物中加入sucrose、tmb和h2o2共同反应，反应后在653nm处测量溶液的吸光度，回收样品，接着调节ph值，在一定温度条件下反应后用pgm测量葡萄糖浓度。

18、优选地，上述的应用，步骤(1)中～步骤(2)中，将30μl的10mg/ml cpba-fe3o4引入200μl含e.coli和s.aureus的hepes(100mm,ph＝6.5)中进行孵育30min，反应后进行磁分离、洗涤三次，得到多种细菌共轭物。

19、优选地，上述的应用，步骤(3)中，加入60μl的600mm sucrose、5μl的20mm tmb和7μl的6mm h2o2共同反应10min，反应后在653nm处测量溶液的吸光度，回收样品，接着用naoh将溶液ph值调为7.5，在62℃下反应20min后用pgm测量葡萄糖浓度。

20、综上，本发明提出了一种同时检测多细菌的多模式组合纳米探针及制备方法与食源性致病菌检测的应用。

21、上述原理为：所述标记物可在同一环境下产生两种相互独立的检测信号，其中标记物hrp在特定波长653nm处产生紫外吸光度，标记物inv催化双糖水解可以测量pgm值。此外，所述cpba-fe3o4在实验中被用于磁性分离和捕获细菌，机理是cp ba-fe3o4与金黄色葡萄球菌或大肠杆菌形成复合物，该复合物与hrp@zif-90-pigg或inv@zif-90-aptamer之间形成夹层复合物，通过外加磁场的作用，将被捕获目标菌与样品液进行分离及重悬等步骤，即可获得目标细菌。磁分离技术同时结合相互独立的检测信号和双位点识别策略，建立了双模式多重免疫分析法用于同时检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。而基于紫外比色和血糖计为输出信号的双模式免疫分析法具有良好的抗干扰能力和优异选择性，在复杂的实际样品中取得了满意的检测结果。

22、本发明与现有技术相比，具有以下特点：

23、本发明创造性地将两种相互独立的检测信号与磁分离技术和双位点识别策略相结合，避免了同一环境中多种检测信号同时输出时产生交叉干扰的问题，实现对多种食源性致病菌的同时检测，对准确控制食源性致病菌具有重要意义。

24、本发明中的hrp@zif-90和inv@zif-90能共存并同时发生催化反应产生双模式信号，证明了该组合纳米探针可以同时产生两种完全不同的检测信号，解决了多细菌检测中因检测信号类型单一引起的信号交叉干扰的问题，并具有较高的可行性。

25、本发明的同时检测多细菌的多模式组合纳米探针的检测准确性与无信号干扰的单细菌检测别无二致，即同时检测多细菌的多模式组合纳米探针在对多种目标定性定量检测时准确性高于其他多目标检测方法。