调控四唑类化合物显色反应灵敏度的方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及调控四唑类化合物显色反应灵敏度的方法。

背景技术：

1、四唑类化合物的中心结构四唑为含四个氮原子和一个碳原子的带正电荷的五元杂环结构，其被三个芳香基团包围，通常为苯基。通过破坏四唑环，四唑化合物可以从无色或浅色水溶液被还原为颜色鲜艳的甲臜衍生物，这使其成为氧化还原组织化学和生化应用的重要染料。常见的四唑类化合物有硝基蓝四唑(nitrotetrazolium blue chloride，nbt)、噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，mtt)、xtt钠盐(xttsodium salt，xtt)以及水溶性四唑(water-soluble tetrazolium，wst)类如wst-1、wst-8、wst-9等。根据分子所带电荷的不同，可将四唑类化合物分为两类：带正电荷的四唑盐如nbt、mtt等和带负电荷的四唑盐如xtt、wst-1、wst-8、wst-9等。

2、四唑类化合物的氧化还原显色特性被广泛应用于生物组织样品、微生物、生物体液中细胞的代谢检测，通常将四唑化合物溶解在水中作为液体试剂使用。考虑到不同四唑化合物的显色颜色不同，如nbt的还原产物为紫色、wst-8的还原产物为橙黄色；且不同类型四唑化合物对于细胞代谢氧化还原检测的反应敏感位置也存在差异，如带正电荷的四唑类化合物主要在细胞内被氧化还原酶还原，带负电荷的四唑类化合物主要在细胞表面通过跨质膜电子传递反应。因此根据应用场景的不同，会同时使用到多种类型的四唑类化合物，不过此类试剂价格昂贵，较不稳定，尤其是生成产物具有水溶性质的水溶性四唑化合物更是价格不菲，大大提高了科学及实验研究的费用。

3、目前已被报道的可以改变四唑类化合物显色的试剂主要为吩嗪硫酸甲酯(pms)和心肌黄酶。他们可用来提高四唑类化合物的显色灵敏度，但pms对光的敏感度较高，化学性质极不稳定，酶类试剂的保存条件也相对苛刻且价格昂贵。此外，水溶性的四唑化合物更是价格不菲，大大提高了科学及实验研究的费用。同时，当多种四唑类化合物同时使用时，为了实现显色特异性，需要选择性地增强或抑制某些四唑化合物的显色，但此类的研究并未找到。

4、因此，在不影响结果解读的前提下，提供了一种简单、经济、稳定的可以选择性调控四唑类化合物的显色反应灵敏度的方法至关重要。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供调控四唑类化合物显色反应灵敏度的方法。

2、本发明提供了表面活性剂在调控四唑类化合物的显色反应中的应用。

3、进一步的，所述调控包括升高或降低。

4、本发明使用表面活性剂对四唑类化合物显色反应强度进行调控，与其他现有的显色反应试剂(如pms、心肌黄酶)相比较，具有更经济、稳定、易保存的特点；且本发明中所述的调控包括提高和抑制，为样品的检测效果的提高提供了可选择性，在实际操作中，可更灵活的对样品显色反应进行调整，从而节约试剂成本或拉大显色反应差距，更利于检测。

5、本发明提供了四唑类化合物的显色反应体系，其包括水、四唑类化合物和表面活性剂；

6、所述四唑类化合物浓度为0.05g/l～5g/l；

7、所述表面活性剂浓度为0.05g/l～5g/l；

8、所述四唑类化合物和表面活性剂的质量浓度比为1:(0.1～10)；在本发明的具体实施例中，所述四唑类化合物和表面活性剂的质量浓度比可以为1:0.1，也可以为1:1，也可以为1:10，优选为1:1，调节效果好且相对更节省试剂成本。

9、进一步的，

10、所述表面活性剂包括阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂；

11、所述四唑类化合物具有如下所示结构：

12、

13、其中，

14、r1选自苯基，苯基取代物，噻唑环，噻唑环取代物或酰亚胺基中的任意一种；

15、r2选自苯基，苯基取代物，噻唑环，噻唑环取代物或酰亚胺基中的任意一种；

16、r3选自苯基，苯基取代物，噻唑环，噻唑环取代物或酰亚胺基中的任意一种。

17、更进一步的，

18、所述四唑类化合物包括nbt(硝基蓝四唑)、mtt(噻唑蓝)、xtt、wst-1、wst-8或wst-9中的至少一种；

19、所述阳离子表面活性剂选自伯胺盐表面活性剂、仲胺盐表面活性剂、叔胺盐表面活性剂、季铵盐表面活性剂、烷基咪唑啉盐表面活性剂、烷基吡啶盐表面活性剂、β-羟基胺表面活性剂和/或鏻盐表面活性剂中的至少一种；所述季铵盐表面活性剂选自苯扎溴铵、溴代十六烷基吡啶和/或十六烷基三甲基溴化铵中的任意一种或多种；

20、所述阴离子表面活性剂选自羧酸盐表面活性剂、磺酸盐表面活性剂、硫酸酯盐表面活性剂、磷酸酯盐表面活性剂、酚盐表面活性剂、烯醇盐表面活性剂、酮基磺胺盐表面活性剂和/或配位式阴离子盐表面活性剂中的至少一种；

21、所述两性离子表面活性剂选自氨基酸型表面活性剂、甜菜碱型表面活性剂、磺酸盐型表面活性剂、硫酸酯盐型表面活性剂、咪唑啉盐型表面活性剂、磷酸酯盐型表面活性剂和/或氧化胺型表面活性剂中的至少一种；

22、所述非离子表面活性剂选自聚乙二醇型表面活性剂、多元醇型表面活性剂、烷基醇酰胺表面活性剂和/或烷基多苷型表面活性剂中的至少一种。

23、在本发明的实施例中，

24、所述阳离子表面活性剂为苯扎溴铵、十八烷基胺盐酸盐或十二烷基二甲基苯基溴化鏻中的至少一种；

25、所述阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠或十二酰-n-甲基甘氨酸钠中的至少一种；

26、所述两性离子表面活性剂为硫代甜菜碱8或环烷酸咪唑啉中的至少一种；

27、所述非离子表面活性剂为壬基酚聚氧乙烯醚、triton x-100或烷基多苷乙氧基化物中的至少一种。

28、具体的，

29、所述阳离子表面活性剂为苯扎溴铵；

30、所述阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠；

31、所述两性离子表面活性剂为硫代甜菜碱8；

32、所述非离子表面活性剂为壬基酚聚氧乙烯醚或triton x-100中至少一种。

33、在本发明的具体实施例中，

34、苯扎溴铵季铵阳离子表面活性剂对精液样品显色强度提升最好，十八烷基胺盐酸盐伯铵阳离子表面活性剂对精液样品显色强度提升次之；

35、十二烷基硫酸钠硫酸酯盐阴离子表面活性剂对精液样品显色强度抑制程度最高，十二酰-n-甲基甘氨酸钠羧酸盐阴离子表面活性剂对精液样品显色强度抑制程度次之；

36、硫代甜菜碱8甜菜碱型两性离子表面活性剂对精液样品显色强度提升较好，但弱于苯扎溴铵；

37、壬基酚聚氧乙烯醚或triton x-100聚乙二醇型非离子表面活性剂与正电荷四唑化合物的组合对样品显色强度具有一定的提高，壬基酚聚氧乙烯醚或triton x-100聚乙二醇型非离子表面活性剂与负电荷四唑化合物的组合对样品显色强度产生抑制，抑制效果与十二烷基硫酸钠相当。

38、对样品检测，针对其不同显色情况，选择合适的表面活性剂对其显色强度进行升高或降低，有利于样品显色结果的观察，从而更利于检测。在一些具体的实施例中，降低显色剂的显色强度适用于当显色剂的配制浓度较低情况下显色仍很深的一组样品，可以拉开一组样品的显色差距；提高显色剂的显色强度可以节省四唑类化合物的试剂用量，节约成本。并且，本发明显色反应体系对显色的调节仅与四唑化合物类型相关，与样品类型无关，降低了显色调节的复杂程度。

39、本发明提供了显色方法，其为利用本发明所述的显色反应体系对样品进行显色。

40、进一步的，本发明所述的显色方法，包括如下步骤：

41、步骤1、表面活性剂、水和四唑类化合物混匀后滴加于滤纸片，制成干化滤纸片；

42、步骤2、将样品滴加于所述干化滤纸片进行显色反应。

43、所述滤纸片的材质为硝酸纤维素、玻璃纤维素、混合纤维素或棉质纤维素中的任意一种；

44、所述干化滤纸片的制备条件为20℃～45℃，避光真空干燥20min～50min；

45、所述显色反应的条件为37℃，避光孵育10min。

46、所述样品包括生物体液样品和/或细菌悬液中的任意一种，所述生物体液样品包括血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、泪液、宫颈阴道液和/或精液中的任意一种。

47、在本发明的具体实施例中，所述干化滤纸片的制备条件为37℃，避光真空干燥30min即可，此时制备时间相对较短、保存更稳定，也更利于梯度显色。

48、本发明提供了四唑类化合物显色反应体系，在其中添加表面活性剂来调节四唑类化合物的显色反应灵敏度，可以根据需要增大或缩小显色反应强度，有利于样品显色结果的观察。试验结果表明：季铵阳离子表面活性剂对四唑化合物类型显色强度提升最好；硫酸酯盐阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠对四唑化合物类型显色强度抑制效果最好；壬基酚聚氧乙烯醚或triton x-100的非离子表面活性剂对正电荷四唑化合物的显色强度具有一定的提高，对负电荷四唑化合物的显色强度产生抑制，抑制效果与十二烷基硫酸钠相当。本发明所述显色反应体系在同等试剂浓度下，可以选择性调控四唑类化合物的还原显色的反应灵敏度，与其他试剂相比，具有更经济、稳定、易保存的特点。