消除甜点效应的MALDI定量检测小分子生物物质的芯片及检测方法与流程

本发明提供消除甜点效应的飞行时间质谱(maldi tof)定量检测小分子生物物质的产品及其检测方法，具体属于生物分子检测领域。

背景技术：

1、maldi-tof-ms(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,英文名matrix-assistedlaser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，通过激光与引入基质分子相互作用，使待测分子离子化，解决了非挥发性和热不稳定性生物分子解吸离子化的问题，具有操作简单、快速、谱图直观、能耐受一定浓度的盐和去垢剂等特点，特别适合于临床快速检测。

2、仪器主要由两部分组成：基质附助激光解吸电离离子源(maldi)和飞行时间质量分析器(tof)。maldi的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。tof的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(m/z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。

3、maldi-tof-ms以其操作方便、样品分析通量高的独特优势，在临床诊断中的应用引起了人们的关注。目前已应用于临床实验室鉴定致病菌，检测单核苷酸多态性。近年来，基于maldi-tof ms的体液小分子代谢分析在各种疾病的诊断中引起了极大的兴趣。然而，传统maldi-tof ms用于小分子代谢谱分析有两个主要局限性。首先，传统的有机基质，如α-氰基-4-羟基肉桂酸(chca)和2,5-二羟基苯甲酸(dhb)，在低分子量(lmw)区域(<500da)本身表现出很强的峰，干扰了小分子代谢产物的检测。其次，由于传统的maldi-tof-ms制备样品的方法是(由下往上)：分子-基质、基质-分子-基质，分子基质混合，然后再对样品进行晾干。如果基质-分子的共结晶出现不均匀，以及点样晾干时的咖啡环效应，分子在基底上极其不均匀，使得分子聚集导致信号很强的区域，该区域即是“甜点”。这种分布不均匀导致检测时点与点之间信号差异特别大，会使得选点时存在随机性以及主观性，从而无法准确分析实验结果进行。因此，这种甜点效应限制了传统maldi的定量分析的准确性和可重复性。

4、雌酮(e1)是人体及动物自身分泌的一种雌性激素,也是环境雌激素中具有优先权的一类物质。

5、雌激素医用治疗及工业、生活排废等会使雌酮在江河、湖泊、水库等水体中累积,造成环境水体的污染,继而由于生物富集作用进入食物链,造成食品污染。雌酮已证实在很低的浓度下就会干扰人体内分泌系统,危害人体生殖机能,阻碍卵细胞生长,抑制精子产生,对人体健康的影响不容小觑。因此,建立特异性强,灵敏度高的雌酮检测方法已成为环境内分泌干扰物质研究领域中一大课题及改善食品安全现状、保护人类健康所要关注的问题之一。

6、维生素d(简称vd)是一种脂溶性维生素，乃环戊烷多氢菲类化合物，一组结构上与固醇有关，功能上可防止佝偻病的维生素，最主要的是维生素d3与d2。

7、维生素d的主要作用是调节钙、磷代谢，促进肠内钙磷吸收和骨质钙化，维持血钙和血磷的平衡。具有活性的维生素d作用于小肠黏膜细胞的细胞核，促进运钙蛋白的生物合成。运钙蛋白和钙结合成可溶性复合物，从而加速了钙的吸收。维生素d促进磷的吸收，可能是通过促进钙的吸收间接产生作用的。因此，活性维生素d对钙、磷代谢的总效果为升高血钙和血磷，使血浆钙和血浆磷的水平达到饱和程度。有利于钙和磷以骨盐的形式沉积在骨组织上促进骨组织钙化。

8、低1，25-二羟基维生素d3水平会使肠钙吸收减少，从而导致继发性甲状旁腺功能亢进，而继发性甲状旁腺功能亢进会经激活破骨细胞导致骨量减少和骨质疏松并增加骨折的风险。许多研究显示，补充钙和至少800iu的维生素d能减少65岁以上老年人的骨折风险，且即使骨密度变化很少，骨折风险也下降了1/3，这与维生素d能增加肌力和平衡有关。

9、maldi做小分子定量的方法和产品与传统的方法和产品相比，具有以下特点：

10、①操作简单、快速。可将生物材料直接加到maldi样品靶上并使用maldi-tof质谱仪进行分析，谱图识别可以在几分钟内完成，且数据评估同测定直接连接。

11、②重复性好。在很宽的条件范围内，maldi方法都被证明是很稳定的。

12、③准确度高。

13、然而，这些小分子生物分子的分子量通常小于1000，当与基质-分子结合，基质相对较大的分子量，使得二者的共结晶出现不均匀，以及点样晾干时的咖啡环效应，因此出现的甜点效应严重影响maldi的定量分析的准确性和可重复性。

14、为了解决上述问题，纳米材料辅助激光解吸电离技术克服了在一定程度上可以克服了maldi-tof ms分析小分子代谢物的局限性。表面粗糙、孔径小的纳米材料可以有效增强代谢物的解吸和电离，消除来自基质的背景干扰。此外，在激光照射下，改变元素组成可导致基质相变和被分析物与基质之间的相互作用发生显著差异，用于敏感代谢物检测。无机纳米材料还可以促进分析物的均匀分布，从而减少“甜点”效应。例如，李宁(利用微纳结构提高表面增强拉曼光谱及激光解吸电离质谱的检测性能，吉林大学博士学位论文，2017)公开了在基底表面制备超疏水纳米结构，使银纳米粒子在毛细力的诱导下聚集成高密度sers热点，并且分子只在热点处。从而实现了多种分析物的痕量检测。同时，以用点状聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)修饰疏水硅纳米柱阵列为质谱检测的靶板，在利用pmma吸附疏水性的蛋白、多肽作用和基底的疏水作用，实现了maldi ms无内标物的定量分析。以制备的超疏水金膜覆盖的硅锥阵列为质谱测试的靶板，使光子能量聚集在结构尖端，同时使分析物分子富集在锥结构尖端，从而提高激光能量的利用率，进而提高分析物分子的解吸电离效率。然而，该技术需要对靶板表面进行超疏水金膜覆盖的硅锥阵列，对于靶板加工过程提出较高的工艺要求。

15、梁倩(金纳米颗粒修饰的共价有机框架材料用于基质辅助激光解析/电离质谱分析小分子，《分析化学》，2021年第49卷第10期)公开了利用金硫键相互作用将金纳米颗粒固定在带有硫醚悬臂的二维共价有机框架(ttb-cof)上，制备了一种金属有机复合材料(au-ttb-cof)，用于基质辅助激光解吸/电离质谱(maldi-ms)分析小分子物质。与前期报道的基质相比，au-ttb-cof将cof材料对紫外光的吸收和金纳米颗粒所具有的促进激光能量转移作用相结合，提高了分析物的电离效率，显著提高了小分子maldi-ms分析的灵敏度。同时，au-s键的稳定性有效降低了基质背景干扰，提高了分析的重现性和耐盐能力。

16、中国发明专利申请201610974371.9、发明名称“一种通过消除甜点效应提高质谱检测重复性的方法”提供了以聚甲基丙烯酸甲酯点修饰的硅片基底(即芯片)表面的疏水硅纳米柱阵列，提供该阵列提供待测分子均匀的吸附位点，能有效地减少甜点效应。

17、中国发明专利申请202210344314.8、“dhb-zn mof纳米材料作为基质在质谱分析检测中的应用”公开了以dhb-zn mof纳米材料作为基质应用于待测物的基质辅助激光解吸电离质谱)检测中提高检测灵敏度。所述待测物具体可为甘油二酯、甘油三酯、神经酰胺、脂肪酸、儿茶酚胺(包括去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺)、异丙肾上腺素和葡萄糖中的至少一种。

18、中国发明专利申请202110258814.5、“一种多层空心氧化物的微球材料及合成方法和在代谢物检测中的应用”公开了以多层空心氧化物(cr2o3)微球材料作为基质，能在maldi tof ms中检测氨基酸，糖类，醇类，肌酸酐，嘌呤及嘧啶等小分子物质。

19、综上所述，现有技术对于消除甜点效应的飞行时间质谱的技术，多是采用纳米金属粒子来替代、修饰或处理基底、芯片基质(即靶板)的材质，例如直接用纳米材料当基质，例如多层空心氧化物(cr2o3)微球材料作为基质，而不是通过添加其他有机基质来消除甜点效应，这对于靶板加工过程提出较高的工艺要求，因此现有技术中并没有通过改进点样基质来消除甜点效应的产品和方法。

20、因此，目前需要一种改进的新型点样基质以及芯片，以消除在检测小分子生物分子(分子量范围1-1000，例如：维生素，雌酮，氨基酸，小分子药物)中极易出现的甜点效应。

技术实现思路

1、本发明第一原理在于：在点样基质中引入金纳米粒子，使得纳米粒子与基质结合，由纳米粒子与同时具有亲脂性与亲水性的双极性分子通过自组装形成可以包裹水相血清样品的微胶囊，通过纳米粒子与传统有机基质结合抑制杂峰，并使结晶均匀，从而拉平“甜点”与“非甜点”区域的差异。

2、本发明第二原理在于：利用多孔薄膜材料(20μm到500μm)，预先将基质预埋到检测基底(即芯片上)，通过多孔薄膜覆盖基质抑制杂峰，并分开基质与样品，使得样品单一结晶比混合结晶更均匀，从而拉平“甜点”与“非甜点”区域的差异。其中，所述基质可以是点样基质或引入金纳米粒子的点样基质。

3、本发明第三原理在于：由于在检测过程中，仪器漂移造成质量轴不稳定，而内标参与结晶造成"甜点"效应更严重。因此，利用多孔薄膜材料(20μm到500μm)，同时将基质和内标预埋到检测基底(即芯片上)，通过多孔薄膜覆盖基质抑制杂峰，并利用内标减少因仪器漂移造成质量轴不稳定所带来的系统误差，进一步拉平“甜点”与“非甜点”区域的差异。

4、综上，本发明通过上述多个发明原理来逐步解决maldi tof ms在检测生物小分子中存在的甜点效应的问题，并完成定性定量的检测。

5、因此，本发明第一目的提供一种在质谱检测生物小分子中降低甜点效应的点样基质，该基质包含金纳米粒子复合物，所述复合物胶体是pfdt-aunps胶体。

6、在一个实施方案中，所述复合物的制备步骤包括：

7、将富含巯基的1h、1h、2h、2h-全氟癸硫醇(pfdt,97％)修饰金纳米颗粒，其中pfdt的-sh与纳米金颗粒反应，形成双极性团簇粒子复合物，该复合物具有强的脂溶液性或疏水性。

8、在一个具体实施方案中，由于金纳米颗粒具有亲水性，当加入待测分子溶液时，金纳米颗粒吸附并包裹在待测分子周围，通过自组装形成包括待测分子的微囊泡或微胶囊，使得待测分子样品均匀分散在脂质溶液中。其中，所述微囊泡或微胶囊是分散质。

9、在另一具体实施方案中，当在油相pfdt-aunps中摇加水相待测分子溶液时，混匀后通过金纳米颗粒吸附和包裹作用，形成胶体溶液。该胶体包含溶剂组成的分散系，和由微囊泡或微胶囊组成的分散质，平均粒径为200 -300μm。

10、本发明第二目的是提供一种在质谱检测生物小分子中降低甜点效应的检测芯片，其中通过多孔薄膜材料预先将点样基质预埋到检测产品中的检测芯片。

11、在一个实施方案中，所述芯片主体选自质地坚韧、平面度佳的单面抛光的金刚石、石英、硅、钢、玻璃、塑料的芯片。在一个具体实施方案中，所述芯片表面具有亲水疏水差异设计，能够有效富集样本，晶向均一生长，质谱检测的样本峰准确度高，信噪比高，基线低。在其他具体实施方案，在芯片点样区表面通过自动点样覆盖基质，特种的基质配方，使基质与样品在芯片表面共结晶更均匀，检测结果更佳。

12、在优选实施方案中，所述芯片是单面抛光的硅芯片或石英芯片，所述亲水性点样孔层薄膜厚度为500nm，所述孔外区的接触角为＞120°，所述芯片上的亲水点样孔数量为24、40、70或384孔，所述亲水性点样孔的孔径范围为0.5-2.8mm，所述芯片尺寸为20×30-83×125mm，优选亲水性点样孔为圆形，直径为0.7mm。

13、在另一实施方案中，多孔薄膜材料的孔径为20μm到500μm，所述薄膜选自二氧化硅氧化物薄膜、氧化锌薄膜、氧化铝薄膜、派若林、聚丙烯、聚氯乙烯或聚四氟乙烯薄膜。

14、在一个具体实施方案中，所述派瑞林包括n膜，c膜或者a膜。

15、在上述任一实施方案中，其中所述基质是点样基质或引入金纳米粒子的点样基质。

16、本发明第三目的是在上述目的的基础上，提供一种在质谱检测生物小分子中降低甜点效应的芯片，该芯片包括上述点样基质以及内标，其中，通过多孔薄膜材料预先点样基质以及内标同时预埋到检测芯片。

17、在一个实施方案中，多孔薄膜材料的孔径为20μm到500μm，所述薄膜选自二氧化硅氧化物薄膜、氧化锌薄膜、氧化铝薄膜、派若林、聚丙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯薄膜或聚-对-二甲基苯薄膜。

18、在一个具体实施方案中，所述派瑞林包括n膜，c膜或者a膜。

19、在上述实施方案中，所述内标是包括25-hydroxyvitamin d2-d3。

20、本发明第四目的是提供一种具有降低甜点效应的质谱检测生物效分子的方法，步骤包括：使用上述点样基质、芯片和/或质谱检测产品，对待测小分子样品进行前处理后，进行质谱检测。

21、在一个实施方案中，步骤包括将前处理的样品溶液，点样在预埋点样基质和/或内标的芯片，自然晾干后，进行maldi-tof质谱定量分析。

22、在上述任一实施方案中，所述质谱是maldi tof ms。

23、在上述任一实施方案中，所述生物小分子是分子量(道尔顿)小于1000的氨基酸、激素、维生素、小分子药物。

24、本发明第五目的是提供包含上述点样基质、内标、芯片和质谱检测产品。

25、在一个实施方案中，所述检测产品是检测试剂盒。在一个具体方案中，所述的试剂盒，还包括芯片适配器，设计了不同的卡槽，可放置多张芯片，能实现核酸与蛋白不同样品同时进样检测，节省质谱开门关门时间。在另一具体实施方案中，所述芯片适配器包括二个磁性贴片，可吸附芯片，使得芯片进入质谱仪器过程当中，或者在实验过程当中防止芯片意外跌落到仪器当中。

26、在另一具体实施方案中，芯片主体为一次性材料，使用后即可替换新的芯片与适配器进行配合，避免现有的金属靶板的清洗和样品污染。

27、在优选的实施方案中，所述芯片适配器可以根据芯片尺寸设计不同的卡槽，卡槽尺寸为20×30-83×125mm，以实现一个适配器保证不同规格的芯片进入检测室。10.根据权利要求9所述的用途，所述适配器上的微阵列芯片卡槽尺寸为20×20mm-25×60mm，卡槽为2、4、6、8、12、16或20个。

28、在上述任一实施方案中，所述质谱是maldi tof ms。

29、技术效果

30、1.本发明提供的消除甜点效应的maldi定量检测小分子生物物质的产品及其检测方法能够有效抑制基质峰对于小分子质谱峰的干扰，操作简便，自动化程度高，使maldi-tof采集质谱谱图s/n高，质量精度高，谱图重复性好，定性与定量结果准确率高，可实现maldi对临床小分子定性、定量的快速质谱检测。

31、2.本发明提供的纳米金粒子，该粒子与同时具有亲脂性与亲水性的双极性分子通过自组装形成可以包裹水相血清样品的微胶囊，能使得待测分子样品均匀分散在脂质溶液中。

32、3.本发明改变了现有技术中，将纳米金属粒子修饰靶板的复杂工艺，首次采用将点样基质和纳米金属粒通过紫外照射薄膜多孔材料，沉积覆盖在基质上，就完成精确覆盖点样区，相比于传统方法，具有节省成本，减少工序的优点，同时使结晶均匀，从而拉平“甜点”与“非甜点”区域的差异.

33、4.本发明所用材料易于制备，且性能稳定，能长期保存。

34、术语和定义

35、疏水性(hydrophobicity)：在化学学科里，疏水性指的是一个分子(疏水物)与水互相排斥的物理性质。疏水性分子偏向于非极性，并因此较会溶解在中性和非极性溶液(如有机溶剂)。疏水性分子在水里通常会聚成一团，而水在疏水性溶液的表面时则会形成一个很大的接触角而成水滴状。举例来说，疏水性分子包含有烷烃、油、脂肪和多数含有油脂的物质。

36、亲水性(hydrophilic property)：指分子带有极性基团的分子，对水有大的亲和能力，可以吸引水分子，或溶解于水。这类分子形成的固体材料的表面，易被水所润湿。具有这种特性都是物质的亲水性。

37、基质，指对特定波长具有较强吸收并易于被激发，并且传递能量和电荷给待测分子发生气化和离子化，从而使得所包含的待测分子一起进入质谱检测通道的特殊溶液。

38、好的基质要具备下列几种特点：a.基质最重要的功能就是吸收脉冲激光的能量，既可以通过电离吸收紫外区激光的能量，也可以通过分子的化学键振动吸收红外区激光的能量，这由所采用的激光波长来决定。b.基质要能够很好地分散样品分子，防止其聚集，提高电离效率。c.固、液相的基质、样品混合物在解吸时，基质分子不再产生额外的热效应，不会破坏待测分子。d.基质必须能够帮助样品分子很好地电离。如果是液态基质，还必须具有很好的真空稳定性。

39、“表面覆盖基质”，指根据待检分子的种类，预先覆盖在点样区的小分子药物基质，并干燥形成结晶。通过将芯片的表面预先覆盖基质，可制备成一次性或直接对样品进行点样和检测的产品或试剂盒。