基于高光谱技术的灵芝孢子粉多指标快速检测方法与流程

本发明涉及高光谱图像检测领域，具体涉及一种基于高光谱技术的灵芝孢子粉多指标快速检测方法。

背景技术：

1、灵芝是一种常见的药用真菌，应用历史悠久，也是我国传统名贵中药，具有补气安神，止咳平喘等功效。灵芝孢子是灵芝的繁殖体，也被称为灵芝孢子粉。灵芝孢子含有丰富的活性成分，如多糖、三萜、脂肪酸等，具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗炎、改善心血管等多种功效。水分和过氧化值与灵芝孢子粉腐败、氧化密切相关，是重要的安全指标。此外，灵芝孢子有双层孢壁结构，主要由几丁质等物质构成，质地坚韧，阻碍了多糖、三萜等有效成分的溶出。破壁率是指灵芝孢子粉中破裂孢子的比例，破壁率越高，内部的成分更容易释放。因此，与多糖、甘油三油酸酯、水分及过氧化值等指标一样，破壁率也可以作为衡量破壁灵芝孢子粉质量的重要指标之一。因此，有必要采用先进分析仪器及技术开发灵芝孢子粉多指标快速、无损检测的方法。

2、目前，破壁灵芝孢子粉的破壁率测定主要通过血球计数板对未破壁的孢子进行计数，单位质量破壁灵芝孢子粉中完整孢子的数量，从而获得破壁灵芝孢子粉的破壁率。该方法检测成本低且操作较为方便，但存在人为判断误差较大、镜检视野的局限性及样品损耗等问题。多糖、甘油三油酸酯、水分及过氧化值等指标的检测方法也存在耗时耗力且损耗样品等问题。因此，有必要开发灵芝孢子粉多指标的快无损检测方法。

3、为了克服以上技术缺陷，中国专利cn 103983605 a申请了“一种快速无损检测破壁灵芝孢子粉破壁率的方法”介绍了采用近红外光谱仪采集待测样本的近红外光谱数据；对所述待测样本的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理；采用依据偏最小二乘回归法所建立的破壁率预测模型来检测所述待测样本的破壁率。中国专利cn 116413237 a申请了“一种基于近红外光谱技术的灵芝孢子质量评价方法”介绍了采用近红外光谱分析技术分析灵芝孢子粉，在使用可见分光光度法和hplc法的基础上，结合偏最小二乘法建立一种基于近红外定量分析灵芝孢子粉粗多糖和甘油三油酸酯含量的模型。这两项专利均可有效降低样品损耗、污染，但是近红外光谱技术仅是一维光谱数据，对于灵芝孢子粉破壁率、多糖、甘油三油酸酯、水分及过氧化值的检测仍然不够精确。

4、近年来，高光谱检测已被应用于药材成分、真伪鉴别及产地识别等，具有快速、准确、无损等优势。因此，本研究使用高光谱成像技术采集破壁灵芝孢子粉的高光谱数据，在对比研究多种光谱预处理、光谱特征提取及机器学习回归算法组合的基础上，建立了灵芝孢子粉多指标的预测模型，开发了快速、准确、无损的灵芝孢子粉多指标的检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了开发一种基于高光谱技术的灵芝孢子粉多指标快速检测方法，以解决目前检测方法耗时耗力、检测方法步骤复杂及易使样品遭到破环的问题。

2、为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

3、本发明提供一种基于高光谱技术的灵芝孢子粉多指标快速检测方法，包括如下步骤：

4、a、采集不同批次灵芝孢子粉样品的高光谱图像；

5、b、对采集的高光谱图像进行校正；

6、c、选定感兴趣区域(region of interest，roi)，计算获得光谱数据；

7、d、对所得光谱数据进行预处理：采用一阶导数、二阶导数、标准正态变量变换(snv)、多元散射矫正(msc)、savitsky-golay(sg)平滑、小波变换(wt)中的至少一种。

8、e、建立多指标的定量校正模型：采用竞争性自适应重加权(cars)、及连续投影算法(lar)、无信息变量选择(uve)、最小角回归(spa)、遗传算法(ga)5种特征波段提取方法中的至少一种和偏最小二乘法(pls)、支持向量机(svm)、极限学习机(elm)、多层感知机(mlp)及lightgbm 5种算法中的至少一种，对光谱预处理之后的数据建立多指标的定量校正模型来预测待测样本的破壁率、多糖、甘油三油酸酯、水分及过氧化值指标。

9、优选地，当预测待测样本的破壁率指标时，所述对所得光谱数据进行预处理的方法选自标准正态变量变换、savitsky-golay平滑、多元散射矫正中的至少一种；所述特征波段提取方法选自竞争性自适应重加权、无信息变量选择、最小角回归中的至少一种；所述算法选自偏最小二乘法、支持向量机、极限学习机中的至少一种。

10、进一步优选地，当预测待测样本的破壁率指标时，所述对所得光谱数据进行预处理的方法选自标准正态变量变换、savitsky-golay平滑中的至少一种；所述特征波段提取方法选自竞争性自适应重加权、无信息变量选择中的至少一种；所述算法选自偏最小二乘法、支持向量机中的至少一种。

11、最优选地，当预测待测样本的破壁率指标时，所述对所得光谱数据进行预处理的方法为savitsky-golay平滑；所述特征波段提取方法为竞争性自适应重加权；所述算法选自偏最小二乘法。

12、优选地，当预测待测样本的多糖指标时，所述对所得光谱数据进行预处理的方法选自一阶导数、多元散射矫正中的至少一种；所述特征波段提取方法为竞争性自适应重加权；所述算法选自偏最小二乘法。

13、最优选地，当预测待测样本的多糖指标时，所述对所得光谱数据进行预处理的方法为多元散射矫正。

14、优选地，当预测待测样本的甘油三油酸酯指标时，所述对所得光谱数据进行预处理的方法选自一阶导数、标准正态变量变换中的至少一种；所述特征波段提取方法为竞争性自适应重加权；所述算法选自偏最小二乘法。

15、最优选地，当预测待测样本的甘油三油酸酯指标时，所述对所得光谱数据进行预处理的方法为一阶导数。

16、优选地，当预测待测样本的水分指标时，所述对所得光谱数据进行预处理的方法选自二阶导数、标准正态变量变换中的至少一种；所述特征波段提取方法为竞争性自适应重加权；所述算法选自偏最小二乘法。

17、最优选地，当预测待测样本的水分指标时，所述对所得光谱数据进行预处理的方法为二阶导数。

18、优选地，当预测待测样本的过氧化值指标时，所述对所得光谱数据进行预处理的方法选自二阶导数、标准正态变量变换中的至少一种；所述特征波段提取方法为竞争性自适应重加权；所述算法选自偏最小二乘法。

19、最优选地，当预测待测样本的过氧化值指标时，所述对所得光谱数据进行预处理的方法为标准正态变量变换。

20、优选地，步骤a中，所述采集使用高光谱成像仪器进行；所述高光谱图像，当以破壁率为检测指标时，采集不同批次不同破壁率样本的高光谱；当以多糖、甘油三油酸酯、水分及过氧化值为检测指标时，采集破壁率95％以上不同批次样本的高光谱。

21、优选地，步骤a中，所述采集步骤为：

22、将高光谱成像仪器开机预热，调整高光谱镜头与拍摄样品之间的距离，进行图像采集。

23、进一步优选地，所述预热的时间为20分钟。

24、进一步优选地，所述图像采集的各项参数为：水平移动平台的速度为9.50mm·s-1，样品之间的距离为20cm，电荷耦合器件(ccd)相机曝光时间为26ms。

25、优选地，步骤b中，所述校正的方法选自暗像校正、非均匀性校正、白板校正、光谱消除、辐射校正、黑白板校正中的至少一种，进一步优选为黑白板校正。

26、最优选地，所述黑白板校正公式为：

27、

28、其中r是校准的反射率图像，r0是原始反射率图像，w是白板参考图像，b是黑板参考图像。

29、通过高光谱图像黑白校，可以减小光源不均匀，ccd相机的暗电流以及仪器物理配置的差异对所获得的高光谱反射率图像的影响。

30、优选地，步骤c中，所述选定感兴趣区域的步骤为：

31、黑白板校准后的图像，去除干扰背景和阈值分割之后，将高光谱图像转换成二进制图像。将二值图像应用于原始高光谱图像，得到破壁灵芝孢子粉的感兴趣区域(regionof interest,roi)图像，并对选定的感兴趣区域内每个像素点的光谱反射率进行平均处理作为样品最终的光谱数据，可以获得每份样品的平均光谱数据。

32、优选地，步骤e中，所述多指标的定量校正模型的具体构建步骤如下：

33、e1、选取90％-100％区间及0-100％不同破壁率的破壁灵芝孢子粉作为建立破壁率预测模型所需要的训练样本，选取不同生产批次的破壁灵芝孢子粉作为建立多糖、甘油三油酸酯及水分预测模型所需要的训练样本；

34、e2、采用高光谱成像仪采集破壁灵芝孢子粉样本的高光谱数据；

35、e3、根据浙江省中药炮制规范2015年版-灵芝孢子粉的破壁率、多糖、甘油三油酸酯、水分及过氧化值指标测定要求进行检测；

36、e4、对所述训练样本的高光谱数据进行6种光谱预处理，其次结合5种特征选择算法，最终基于5种机器学习算法建立破壁灵芝孢子粉多指标的定量校正模型。

37、优选地，步骤e3中，所述破壁率的指标检测具体包括如下步骤：

38、(1)称取破壁灵芝孢子粉粉末；

39、(2)加聚山梨酯，得混匀的孢子液；

40、(3)将混匀的孢子液滴入血球计数板；

41、(4)在显微镜下观察，计数，可得破壁率指标。

42、进一步优选地，步骤(3)中，所述将混匀的孢子液滴入血球计数板的具体操作为：

43、取血球计数板(25个中方格×16个小方格)，用吸管吸取混匀的孢子液滴于盖玻片边缘，使液体缓缓渗入，多余的液体用吸水纸擦净。

44、进一步优选地，步骤(4)中，所述显微镜的放大倍数大于200倍。所述计数方法为：计数任意6个中方格中具完整形态的灵芝孢子个数，做3-10次，计算平均数。

45、优选地，步骤e3中，所述多糖的指标检测具体包括如下步骤：

46、(1)制备对照品溶液；

47、(2)制备标准曲线；

48、(3)制备供试品溶液；

49、(4)取供试品溶液，照《中国药典》紫外－可见分光光度法测定吸光度，读数，计算，即得。

50、进一步优选地，步骤(1)中，所述对照品溶液的制备方法为：

51、取无水葡萄糖对照品，加水制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

52、进一步优选地，步骤(2)中，所述标准曲线的制备方法为：

53、分别量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml，各加水补至2.0ml，加入硫酸蒽酮溶液，加热，冷却，以相应的试剂为空白，照《中国药典》紫外－可见分光光度法，测定吸光度，绘制标准曲线。

54、进一步优选地，步骤(3)中，所述供试品溶液的制备方法为：

55、取本品粉末，加水，称定重量，加热，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，滤过，量取滤液2ml，加入乙醇，4放置12小时，离心，沉淀加水溶解，转移至量瓶中，加水至刻度，即得。

56、进一步优选地，步骤(4)中，所述吸光度测定的具体步骤为：

57、测定法量取供试品溶液，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入硫酸蒽酮溶液”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中相当于无水葡萄糖的量，计算，即得。

58、优选地，步骤e3中，所述甘油三油酸酯的指标检测按照《中国药典》高效液相色谱法测定。

59、具体包括如下步骤：

60、以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈－异丙醇(51:49)为流动相；用蒸发光散射检测器检测。理论板数按甘油三油酸酯峰计算应不低于3000，测定法分别吸取参照物溶液及供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。

61、优选地，步骤e3中，所述水分的指标检测具体包括如下步骤：

62、测定法：取供试品，置于称量瓶中，称定，放入减压干燥器中，抽气减压至2.67kpa以下，并持续抽气半小时，室温放置24小时。连接无水氯化钙干燥管，打开干燥器，盖上瓶盖，取出称量瓶称定重量，计算供试品中的含水量(％)。

63、优选地，步骤e3中，所述过氧化值的指标检测具体包括如下步骤：

64、称取制备的试样，置于碘量瓶中，加入三氯甲烷-冰乙酸混合液，加入饱和碘化钾溶液，塞紧瓶盖，在暗处放置3min。取出加水，立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定析出的碘，滴定至淡黄色时，加淀粉指示剂，继续滴定至溶液蓝色消失为终点。同时进行空白试验。

65、本研究为破壁灵芝孢子粉破壁率、多糖、甘油三油酸酯、水分及过氧化值多个指标的快速、准确检测提供了可行的方法。

66、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

67、(1)通过特征波段的筛选能够在确保模型性能的基础上，大幅减少对光谱变量的使用，筛选变量后基本可以达到甚至超过全光谱变量所构建模型的性能。说明利用特征波段提取方法能够排除冗余信息，找到与指标成分密切相关的光谱变量，从而大幅减少计算量。

68、(2)利用sg-cars组合建立的plsr模型，破壁率的定量评价指标都有提升，通过直线拟合可以发现训练集和测试集的破壁率区间为0-100％的灵芝孢子粉破壁率测量值分别与相应的预测值有良好的线性关系。结果也表明该方法适用于不同破壁率的检测，为该方法应用于破壁过程的在线/旁线检测奠定了基础。

69、(3)采用本发明检测破壁灵芝孢子粉的破壁率、多糖、甘油三油酸酯、水分及过氧化值时，由于高光谱成像系统采集数据的时间很短，对光谱数据进行预处理以及回归算法进行运算的时间也很短，因此可以快速、无损的检测待测样本的破壁率，解决了现有的检测方法中所存在人为误差较大、检测方法步骤复杂、成本高及易使样品遭到破环的问题。