一种用于尿路致病性大肠杆菌调控外泌体的试验方法

本发明涉及尿路感染，更具体地说，本发明涉及一种用于尿路致病性大肠杆菌调控外泌体的试验方法。

背景技术：

1、尿路致病性大肠杆菌(upec)是尿路感染(uti)的主要致病病原体，尿路感染也是全世界常见的细菌感染病之一，在先天免疫系统中，上皮细胞和巨噬细胞是最重要的组成部分，在防御upec入侵中起着关键作用，但是上皮细胞和巨噬细胞之间的通讯途径并未完全了解，外泌体是一种微细胞器或小囊泡，它们存在于细胞内，将细胞内的信号分子、蛋白质和rna包裹在小囊泡内传递给其他细胞，从而调控免疫反应、细胞增殖以及凋亡，利用外泌体将废物分子释放到细胞外部，以维持细胞内环境的稳定，外泌体在细胞间通信中扮演着重要角色，帮助不同类型细胞互相作用，并协调生物体的生理活动，目前还没有明确的试验方法用于揭示被称为外泌体的膜结合纳米囊泡在upec感染期间介导细胞间通讯中的作用，无法知晓外泌体对于尿路致病性大肠杆菌调控尿路感染的调控机制，没有对上皮细胞和巨噬细胞之间相互通讯进行明确的数据分析。为了解决上述问题，现提供一种技术方案。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供一种用于尿路致病性大肠杆菌调控外泌体的试验方法，提出明确的试验方法揭示被称为外泌体的膜结合纳米囊泡在upec感染期间介导细胞间通讯中的作用，获取外泌体对于尿路致病性大肠杆菌调控尿路感染的调控机制，对上皮细胞和巨噬细胞之间相互通讯进行明确的数据分析。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种用于尿路致病性大肠杆菌调控外泌体的试验方法，包括如下步骤：

4、步骤一，制备mb49-exo和mb49-u-exo样品，在体内和体外分别进行三次独立实验，观察小鼠巨噬细胞对mb49-exo和mb49-u-exo样品的摄取情况；

5、步骤二，mb49-u-exo加重upec诱导的膀胱炎：小鼠接受膀胱内注射外泌体，1天后经尿道膀胱内注射upec，使用流式细胞仪分析感染2天后小鼠膀胱内f4/80+cd11b+巨噬细胞和cd11b+ly6g+中性粒细胞占比，获取不同处理组小鼠膀胱切片he染色图像，进行组织病理学评分比较；

6、步骤三，mb49-u-exo诱导巨噬细胞分泌促炎细胞因子：将bmdms分别与mb49-exo、mb49-u-exo共孵育，通过转录组测序分析基因表达谱，外泌体刺激后对bmdms进行细胞因子阵列检测，检测各处理组bmdms中tnfα的相对表达及bmdms中tnfα的相对表达；

7、步骤四，mb49-u-exo通过激活mapk/erk、mapk/jnk通路诱导巨噬细胞产生tnfα：获取mb49-u-exo和mb49-exo分别处理后bmdms中erk、p38、jnk、p65磷酸化和总蛋白表达水平，pbs、pd98059、mb49-u-exo、pd98059联合mb49-u-exo处理后bmdms中erk磷酸化和总蛋白表达水平，以及pbs、sp600125、mb49-u-exo、sp600125联合mb49-u-exo处理后bmdms中jnk磷酸化和总蛋白表达水平，用pbs、mb49-u-exo或pd98059、sp600125刺激bmdms后收集上清，测定tnfα的水平；

8、步骤五，mb49-u-exo抑制巨噬细胞吞噬能力：用mb49-exo或mb49-u-exo处理bmdms24小时后与fitc-e.coli共孵育1小时，获取数据分析结果，用mb49-exo或mb49-u-exo处理bmdms 24小时后与egfp-upec共孵育，获取数据分析结果；

9、步骤六，mb49-u-exo通过诱导巨噬细胞产生tnfα导致其凋亡：获取pbs、mb49-exo或mb49-u-exo处理后的bmdms中凋亡细胞占比，同时pbs、mb49-u-exo、tnfα中和抗体或tnfα中和抗体联合mb49-u-exo处理后的bmdms中凋亡细胞占比；

10、步骤七，抑制mb49-u-exo介导的tnfα产生改善upec诱导的膀胱炎：使用pbs、gw4869、tnfα中和抗体分别治疗upec诱导的膀胱炎小鼠，膀胱内注射等体积pbs的小鼠作为膀胱炎小鼠的对照，获取小鼠膀胱中f4/80+cd11b+巨噬细胞和cd11b+ly6g+中性粒细胞占比，获取不同处理组小鼠膀胱切片he染色图像，进行组织病理学评分比较，获取各小鼠膀胱upec细菌负荷；

11、步骤八，mb49-u-exo通过递送mir-18a-5p诱导jnk活化和tnfα产生：收集mb49-exo和mb49-u-exo，使用小鼠mirna微阵列分析芯片进行差异表达mirna分析。

12、作为本发明进一步的方案，在步骤一中，制备mb49-exo和mb49-u-exo样品的具体流程包括：

13、步骤a1：选取尿路致病性大肠杆菌在培养皿中培养，感染mb49细胞；

14、步骤a2：通过离心方法分离培养皿中的上清液，使用差速离心法分离上清液，获取mb49-exo和mb49-u-exo样品；

15、步骤a3：使用电子显微镜获取mb49-exo和mb49-u-exo样品的代表性透射电子显微图像，比例尺为100nm，使用纳米粒度电位仪测量mb49-exo和mb49-u-exo的粒径分布，利用蛋白免疫印迹显示外泌体标记蛋白cd63和hsp90在外泌体或mb49细胞中的表达情况，利用bca法检测两种mb49-exo和mb49-u-exo的蛋白浓度。

16、作为本发明进一步的方案，在步骤一中，在体内和体外分别进行三次独立实验，观察小鼠巨噬细胞对样品的摄取情况的具体方法为：使用流式细胞学分析小鼠接受荧光染料叠氮花菁-cy5.5标记外泌体膀胱内注射12小时后，cd45+f4/80+巨噬细胞在所有cy5.5+膀胱细胞中所占的比例，利用共聚显微成像技术获取cd11b+(绿色)巨噬细胞摄取外泌体(粉红色)的代表性图像，细胞核使用dapi染色(蓝色)，比例尺＝20μm。

17、作为本发明进一步的方案，在步骤二中，小鼠接受膀胱内注射外泌体的剂量为1μg，经尿道膀胱内注射upec的剂量为1.0×108cfu，小鼠膀胱切片he染色图像的比例尺为100μm，利用流式细胞学分析检测小鼠膀胱内免疫细胞数量时的画门策略，分析显示感染2天后小鼠膀胱内f4/80+cd11b+巨噬细胞和cd11b+ly6g+中性粒细胞所占比例以及不同处理组进行组织病理学评分比较的数据分析方式均使用单因素方差分析进行统计学分析。

18、作为本发明进一步的方案，在步骤三中，将bmdms与mb49-exo、mb49-u-exo共孵育的时间为3小时，外泌体刺激后对bmdms进行细胞因子阵列检测，使用双因素方差分析进行统计学分析，用rt-pcr检测不同处理组bmdms中tnfα的相对表达，使用单因素方差分析进行统计学分析，用elisa检测不同处理组bmdms中tnfα的相对表达，使用单因素方差分析进行统计学分析。

19、作为本发明进一步的方案，在步骤四中，mb49-u-exo和mb49-exo分别处理的实验均重复三次，pbs、pd98059、mb49-u-exo、pd98059联合mb49-u-exo处理实验中，pd98059的剂量为20μm，pbs、sp600125、mb49-u-exo、sp600125联合mb49-u-exo处理实验中，sp600125的剂量为40nm，用pbs、mb49-u-exo或pd98059、sp600125刺激bmdms后处理，以上实验均重复三次，且使用单因素方差分析进行统计学分析。

20、作为本发明进一步的方案，在步骤五中，用mb49-exo或mb49-u-exo的剂量为10μg/ml，处理bmdms 24小时后与fitc-e.coli的孵育剂量为50μg/ml，孵育时长为1小时，获取数据分析结果的方式均为共聚焦显微成像技术和流式细胞分析技术，均使用t检验进行统计学分析。

21、作为本发明进一步的方案，在步骤六中，获取的数据使用单因素方差分析进行统计学分析，pbs、mb49-u-exo、tnfα中和抗体或tnfα中和抗体联合mb49-u-exo处理实验中tnfα中和抗体的浓度为100ng/ml。

22、作为本发明进一步的方案，在步骤七中，使用pbs、gw4869、tnfα中和抗体分别治疗upec诱导的膀胱炎小鼠的gw4869剂量为2.5μg/g，tnfα中和抗体的剂量为0.2μg/g，治疗膀胱炎小鼠的时长为3天，小鼠膀胱切片he染色图像的比例尺为100μm，进行不同处理组组织病理学评分比较的数据，使用单因素方差分析进行统计学分析，平板菌落计数法显示不同处理组中小鼠膀胱upec细菌负荷中，以log cfu/膀胱表示，使用单因素方差分析进行统计学分析。

23、作为本发明进一步的方案，在步骤八中，使用小鼠mirna微阵列分析芯片进行差异表达mirna分析的具体方法包括：

24、步骤b1：预测mir-130a-3p、mir-21a-5p和mir-18a-5p与pten基因3'utr的结合位点；

25、步骤b2：利用蛋白免疫印迹显示转染mirna模拟物6小时后的bmdms中pten、jnk磷酸化和总蛋白表达水平；

26、步骤b3：用rt-pcr检测mirna模拟物转染后bmdms中tnfα的相对表达，使用单因素方差分析进行统计学分析；

27、步骤b4：使用差速离心法分别从急性膀胱炎患者和健康志愿者的尿液中提取外泌体，并用rt-pcr检测尿液外泌体中mir-18a-5p的表达水平，使用t检验进行统计学分析。

28、本发明一种用于尿路致病性大肠杆菌调控外泌体的试验方法的技术效果和优点：本发明通过提出的试验方法说明了upec感染后膀胱上皮细胞来源的外泌体能够诱导巨噬细胞产生过量的tnfα，导致巨噬细胞凋亡，并抑制其吞噬功能，使用外泌体分泌抑制剂gw4869或tnfα中和抗体都能通过减少巨噬细胞和中性粒细胞浸润，促进upec清除从而显著改善upec诱导的膀胱炎的病理状态，提出upec感染时膀胱上皮细胞和巨噬细胞之间以外泌体的形式实现交互并调节宿主的免疫反应，揭示了upec调节尿路感染的潜在机制。