一种用于荧光淬灭的淬灭剂、应用的制作方法

本发明属于荧光标记生物样本处理，涉及淬灭剂在荧光淬灭中的应用以及淬灭剂在制备用于荧光标记的生物样本中的应用，具体涉及一种用于荧光淬灭的淬灭剂、淬灭剂在制备用于荧光标记的生物样本中的应用。

背景技术：

1、现阶段荧光染色技术已经在生物医药领域得到了广泛的使用，其中，荧光标记技术(包括免疫荧光标记以及荧光染料标记技术等)是生物医学研究领域使用最广泛染色技术之一，有多种方法和工具可用于实现荧光标记，荧光标记技术主要由探针和检测两部分组成，探针包括荧光染料、荧光蛋白、免疫荧光，检测设备包括荧光显微镜等。由于荧光标记技术可以实现对生物分子和细胞的荧光标记，所以在生物医学研究中具有广泛的应用，如细胞成像、蛋白质相互作用研究、基因表达分析、组织和器官成像、药物筛选和治疗监测等领域。该标记技术具有高度敏感性，多色标记能力及高分辨力，其能够优秀地可视化蛋白质、糖类和小的生物和非生物分子等亚细胞显微结构。

2、然而，大多数的被检测生物样本都具有固有荧光背景，其会减低特异标记荧光信号的信噪比以及对标记信号的检测能力，极大的干扰研究者对特异标记信号的鉴别及检测能力。生物样本固有荧光来源广泛，其可来自组织内天然成分，包括黄酮类化合物、卟啉、叶绿素(在植物中)、胶原蛋白、弹性蛋白、红细胞和脂褐素等。这些成分通常会在可见光谱的绿色和黄色部分具有较强的自发荧光。另外，除了组织固有的自发背景荧光外，免疫染色过程也可能会引入外来的背景荧光，如组织固定中使用醛类化合物(甲醛，福尔马林以及戊二醛等)。这些固定剂通过与蛋白质之间共价结合作用，将细胞组织结构固定为形态稳定的不溶性网状物。在这固定过程中，醛会与胺结合形成席夫碱，导致自发荧光(戊二醛>多聚甲醛>甲醛)(pmid：6404984)。这种因交联剂固定产生的自发荧光具有广泛发射光谱，在蓝色，绿色和红色光谱范围内均可检测到荧光信号。最后，在某些实验操作中，被检测的生物样本可能在预先处理过程中被标记上了特异的荧光信号(如特异染料染色以及荧光蛋白等)。而在最终检测中，实验人员希望去掉这些实验中引入的荧光标记，进而加大特异荧光观测的通量。所有的这些组织样本自有的背景荧光，以及通过实验操作引入的荧光分子，都会干扰最终的希望检测的特异荧光标记，或者降低最终特异荧光标记的能力或通量。所以，高效的淬灭生物样本固有的荧光，是提升样本特异标记荧光信号信噪比，以及增加特异荧光标记数量/通量的一项关键性应用技术。

3、荧光淬灭是指荧光物质的荧光强度降低的任何过程。许多过程都会导致淬灭现象，例如激发态反应、能量转移、配合物的形成和碰撞淬灭。荧光淬灭是一种减少荧光发射的过程。荧光淬灭可以由各种机制引起，包括静态淬灭、动态淬灭以及光漂白等。目前主流的去除生物样本固有荧光的方法是使用自发荧光淬灭试剂，其包括苏丹黑(sudan blackb)，硼氢化物衍生物，以及商用自发荧光淬灭试剂，包括trueblack(biotium)以及trueview(vectorlabs)等。自发荧光淬灭试剂的使用方法简单，其可直接滴加到染色生物样本表面，加入的自发荧光淬灭试剂中的离子可通过碰撞方式，捕获自发荧光光源分子发出的电子，阻止该电子从激发态回归基态进而辐射背景荧光。然而，所有使用自发荧光淬灭试剂去除生物样本固有背景荧光的方案都有几个重要的缺点：

4、第一，生物样本往往含有多种自发荧光分子，且不同的生物样本含有的自发荧光分子种类及数量往往差异很大，因此使用荧光淬灭试剂的效果可能具有很大差异，其很难实现对生物样本固有荧光背景的完全去除。如各类生物样本(石蜡切片、爬片、冰冻组织)，因为组织本身的组份、醛类试剂的固定及高温处理等原因，会导致样品组织及组织内组份(例如黄素、卟啉、植物叶绿素、胶原蛋白、弹性蛋白、红细胞、脂褐素等都会产生较强的自发荧光)等产生显著的自发荧光，进而极大干扰特异荧光标记。

5、第二，自发荧光淬灭试剂在观测样本内一直存在，虽然其可压制样本固有背景荧光，但同时也会降低特异标记荧光的亮度。

6、第三，自发荧光淬灭试剂本身有可能在不同的荧光通道引入新的背景荧光。

7、因此，如何找到一种更为适宜的方式，能够用于去除荧光标记的生物样本存在的固有背景荧光或外来荧光干扰，解决现有的上述方式存在的缺陷，已成为业内诸多一线研究人员亟待解决的问题之一。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供淬灭剂在荧光淬灭中的应用以及淬灭剂在制备用于荧光标记的生物样本中的应用，特别是一种用于荧光淬灭的淬灭剂。本发明提供的淬灭剂应用于背景荧光淬灭法对样本固有荧光分子的淬灭具有不可逆性，而且能够实现快速精准的荧光淬灭，并且完全不会影响后期标记的特异荧光分子的亮度，反而由于背景荧光的完全去除，会进一步增强特异荧光标记的信噪比及特异性。

2、本发明提供了淬灭剂在荧光淬灭中的应用；

3、所述淬灭剂为提供自由基的淬灭剂；

4、所述自由基包括·oh和/或·ho2。

5、优选的，所述淬灭剂中还包括ho2-；

6、所述淬灭剂为h2o2溶液或含有h2o2的混合液。

7、优选的，所述淬灭剂包括h2o2水溶液、h2o2和naoh混合液、h2o2和nahco3混合液、h2o2和cuso4混合液、h2o2和fecl3混合液、h2o2和过氧化氢酶混合液中的一种或多种；

8、所述荧光淬灭具体为差异荧光淬灭法。

9、优选的，所述差异荧光淬灭法的具体步骤包括以下步骤：

10、1)基于要淬灭的生物样本的荧光激发光波长，调整淬灭光源的波长和强度，将采用液体保护的生物样本和淬灭剂置于盛物装置上，在光源的照射和滤光装置的作用下，对生物样本进行光淬灭后，得到消除荧光后的生物样本；

11、所述生物样本具体为经过前处理的生物组织；

12、所述前处理包括细胞爬片、冰冻切片、包埋、切片、烤片、脱蜡至水和抗原修复中的一步或多步；

13、所述光源的波长在200～1600nm内可调；

14、所述光源光照的强度在10～2000klx内可调。

15、优选的，所述液体保护的液体包括水和/或pbs缓冲液；

16、所述光淬灭的时间为1～300min；

17、所述光淬灭的温度为1～70℃；

18、所述光淬灭的湿度为5％～95％；

19、所述消除荧光后的生物样本包括用于进行荧光标记的生物样本。

20、优选的，所述应用的具体方式为，将淬灭剂和待光淬灭的生物样本一同置于淬灭装置中进行应用；

21、所述淬灭装置，包括：

22、光源；

23、设置在光源发射的光线下方的滤光片；

24、设置在滤光片下方的透明盛物装置；

25、设置在透明盛物装置下方的光反射装置。

26、优选的，所述光源具体为平面板状光源；

27、所述光源包括可以发射多种波长和功率可调的光源；

28、所述光源的波长范围为200～1600nm；

29、所述光源包括可见光全光谱led灯或超宽光谱光源led灯。

30、优选的，所述光反射装置包括镜面光反射装置；

31、所述透明盛物装置包括透明托盘；

32、所述透明盛物装置用于放置淬灭剂和待光淬灭的生物样本。

33、优选的，所述荧光淬灭包括背景荧光淬灭、自发荧光、外界物质引入荧光和人工荧光染料荧光中的一种或多种；

34、所述淬灭装置还包括控制模块；

35、所述控制模块用于控制光源，调整功率控制光强和/或设置光照时长；

36、所述淬灭装置具体为可以调控温度和湿度的淬灭装置；

37、所述淬灭装置中还包括压缩机、半导体、散热片和风扇中的一种或多种。

38、本发明还提供了上述技术方案任意一项应用中的淬灭剂在制备用于荧光标记的生物样本中的应用。

39、本发明提供了淬灭剂在荧光淬灭中的应用；所述淬灭剂为提供自由基的淬灭剂；所述自由基包括·oh和/或·ho2。与现有技术相比，本发明研究认为，化学自发荧光淬灭试剂会存在淬灭效果不一致，适用范围窄；影响用户标记目标的荧光染料；在特定荧光光谱中引起背景；无法淬灭人造染料；无法精准差异淬灭以及使用麻烦，成本高等问题。虽然也有一些研究采用光漂白这个方向进行研究，消除组织自发荧光，但需要1～3天的时间。因此，虽然研究人员在光漂白这个方向进行了多种尝试，但是目前相较于荧光淬灭试剂，光漂白并不是目前的主流方法，对于常规生物样本固有荧光的去除方面，光漂白缺点明显，增高光强度或者让样本离光源更近，会使样本温度过高，破坏生物样本物理结构，而且常规的光漂白设备及方案却需要数小时到数天的时间，存在着效率低、光漂白效果不一致、损伤样本以及光源波长不受控制无法实现精准差异淬灭等等问题。

40、基于此，本发明创造性的设计了一种具有特定组成的淬灭剂用于差异荧光淬灭的淬灭装置，本发明提供的带有淬灭剂的荧光淬灭装置对样本固有荧光分子的淬灭具有不可逆性，淬灭速度快且精准，其通过对荧光激发基团共价键的破坏，将使样本固有荧光分子失去荧光激发功能，因此在后期染色过程的任何洗涤处理都不会导致其淬灭效果减弱。背景荧光淬灭体系完全不会影响后期标记的特异荧光分子的亮度，反而由于背景荧光的完全去除，会进一步增强特异荧光标记的信噪比及特异性，具有更好的信噪比(消除背景荧光且不会影响目标荧光亮度)。而且能够重复利用样本进行荧光标记，消除人工荧光染料，如在很多场景中，例如某个样本很珍贵或设备限制只能使用某一种荧光染料，但希望多次染色观察尽可能多的标志物，需要对已经染色的人造荧光染料进行消除。而已有淬灭方案，对人造染料效果不好甚至完全无效，该发明可以普适的淬灭各种类型荧光源。同时该装置适用范围广，兼容性强，使用方便，经济性高可以适用各种类型样本、各种波长荧光源。无需每种荧光单独购买试剂，兼容各种场景，极大节约精力、时间、金钱。更主要的是能够实现精准荧光淬灭，在生物实验过程中存在很多场景，只想淬灭掉某一部分荧光，保留剩余部分荧光，以便实验进行。例如：多重染色，不同轮次间需要可能需要保留dapi的荧光，而本发明则可以通过可控光源+滤光片的方案解决这个问题。

41、本发明提供的采用淬灭剂的淬灭方法，极大的提升了淬灭效率，通过特定的淬灭剂，仅需10分钟即可完成淬灭，而其他光漂白方案一般要6小时以上甚至更久。而且最小化样本损伤，通过智能控制光照策略、环境(温度、湿度等)，最小化对样本的伤害。