一种同时检测三种硝基呋喃类抗生素的试剂盒及其检测模型

本发明涉及化学检测领域，特别是一种同时检测三种硝基呋喃类抗生素的试剂盒及其检测模型。

背景技术：

1、硝基呋喃类抗生素包括呋喃他酮(furaltadone,ftd)、呋喃唑酮(furazolidone,fzd)和呋喃苯烯酸钠(sodium nifurstylenate,nfs)，已广泛用作饲料添加剂，用于治疗某些细菌性感染(wang,liu,wang,chen,&jiang,2018)。由于其代谢产物具有致癌和致突变性，nf类抗生素被列为禁用药物。

2、自1995年起，欧盟(eu)成员国禁止使用硝基呋喃(european commission,2005)。美国和中国也严格禁止在畜牧业中使用硝基呋喃(federal register,2002；regulationof department of agriculture of china,2002)。2019年中国也禁止使用nfs(regulation of department of agriculture of china,2019)。根据食品和饲料快速预警系统(rapid alert system for food and feed,rasff)门户网站的统计数据，2001-2021年水产养殖业中兽药残留量最多的抗生素类药物中，硝基呋喃及其代谢物占19.5％(guardone,tinacci,armani,&trevisani,2022)。因此，监测水产样品中nf代谢产物是保障公众健康和稳定经济增长的重要手段。

3、值得注意的是，nf抗生素在动物体内代谢迅速。ftd主要代谢物为3-氨基-5-吗啉代甲基-2-恶唑烷酮(3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone,amoz)，fzd主要代谢物为3-氨基-2-恶唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone,aoz)(yan et al.,2018)。它们的代谢物与蛋白质结合，从而可以在动物体内稳定存在数周，甚至数月(wang,kou,wang,ma,&wang,2020)。因此，aoz和amoz分别为fzd和ftd标志性代谢物。由于aoz,amoz具有高极性和低分子量的特点，所以利用2-硝基苯甲醛(2-nba)对硝基呋喃的代谢产物进行衍生化检测(cheng et al.,2023)。相反，nfs可以直接检测，无需衍生(song et al.,2019)。2019年，欧盟将动物源性食品中硝基呋喃及其代谢物的参考行动点(reference points for action,rpa)从1.0μg·kg-1降至0.5μg·kg-1(european commission,2019)。这项法规对检测技术提出了更高的要求。目前，nf代谢物的主要分析方法有高效液相色谱-二极管阵列检测(high performance liquid chromatography-diode array,hplc-dad)(fernando,munasinghe,gunasena,&abeynayake,2017)和液相色谱/串联质谱(liquidchromatography/tandem mass spectrometry,lc-ms/ms)(melekhin et al.,2021)。尽管这些方法灵敏度高、稳定性好，但价格昂贵、操作复杂和耗时使它们只能在实验室中进行。此外，基于抗体特异性识别的免疫分析方法是简单方便的。酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,elisa)在小分子药物的检测中具有实用价值，并成功地应用于呋喃妥因(1-aminohydantoin hydrochloride,ahd)(sun,luo,zhang,zhang,&le,2018)，aoz(ding,liu,song,kuang,&

4、xu,2017)，呋喃西林(semicarbazide hydrochloride,sem)(cheng et al.,2023)和amoz(xie,wang,yan,gan,&le,2021)的检测。但对于同时检测多种代谢物时，需要用工作人员分别测试几个平板，因此该方法不适用于各种污染物的现场检测。由于一种食品可能被多种nf污染，因此单个目标测试不足以满足需求。

5、为满足同时检测多种污染物的需要，侧流免疫层析法(lateralflowimmunochromatographic assay,lfia)应运而生。基于胶体金纳米粒子(aunps)的lfia已经成为一种成熟的即时检测的技术(jia et al.,2022)。由于其具有快速、简便、稳定、便携等优点，已被广泛应用于水产品中兽药残留的检测。然而，aunps的缺点是缺乏稳定的精密度和定量能力(lu et al.,2021)。近年来，荧光标记物被广泛应用于lfia方法中，如量子点(qd)(lu et al.,2021)、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,fitc)(cao,chen,&

6、zhao,2019)和镧系元素(xu et al.,2021)。由于eunps具有较长的荧光寿命和较大的斯托克斯位移，因此被广泛应用，它可以帮助lfia分析减少荧光背景信号的干扰，提高其灵敏度(liu et al.,2022)。eunps-fia在抗生素残留检测领域取得了良好的应用(wanget al.,2021)。

7、在这项研究中，构建了基于eunps的多重lfia(eunps-mlfia)用于同时检测三种nf抗生素和代谢物的残留。该方法简便、快速、可靠，适用于单一水产中多种分析物的检测。此外，eunps-mlfia测定对于在食品安全监测领域中的应用将引起消费者和农民的极大兴趣。

技术实现思路

1、为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种同时检测三种硝基呋喃类抗生素的试剂盒及其检测模型，本发明基于铕纳米粒子的灵敏多重侧流免疫层析方法，同时检测水产品中呋喃他酮(furaltadone,ftd)和呋喃唑酮(furazolidone,fzd)的代谢产物以及呋喃苯烯酸钠(sodium nifurstylenate,nfs)残留，检测效率高、效果好，是一种监测多种nf抗生素的有力工具。

2、为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

3、一种同时检测三种硝基呋喃类抗生素的试剂盒，包括：背景板，设置于背景板上的nc膜，设置于背景板上并用于容纳样品的样品垫，包被在nc膜上并位于t线的三种硝基呋喃类抗生素的人工抗原，固定在结合垫上的eunps-mab检测探针，结合在c线上的gam-igg，设置于背景板上的吸收垫。

4、前述的一种同时检测三种硝基呋喃类抗生素的试剂盒，三种硝基呋喃类抗生素的人工抗原为npaoz-ova、npamoz-bsa、nfs-ova。

5、前述的一种同时检测三种硝基呋喃类抗生素的试剂盒，npaoz-ova位于t1位置，npamoz-bsa位于t2位置，nfs-ova位于t3位置。

6、前述的一种同时检测三种硝基呋喃类抗生素的试剂盒，eunps-mab检测探针由eunps-npaoz-mab、eunps-npamoz-mab和eunps-nfs-mab混合而成；

7、前述的一种同时检测三种硝基呋喃类抗生素的试剂盒，eunps-npaoz-mab、eunps-npamoz-mab和eunps-nfs-mab的混合比为：1:1:1-7:8:9；优选为：2:3:4。

8、前述的一种同时检测三种硝基呋喃类抗生素的试剂盒，pbs缓冲液的ph值的范围为5-9；优选为弱碱性，更优选为8。

9、一种同时检测三种硝基呋喃类抗生素的检测模型，包括：

10、一，制备eunps-mab探针：

11、用羧化eunps分别和anti-npaoz-mab、anti-npamoz-mab和anti-nfs-mab制备得到eunps-npaoz-mab、eunps-npamoz-mab和eunps-nfs-mab。

12、二，制备aunps-mab探针：

13、在柠檬酸钠存在下，用氯金酸制备aunps并与mab偶联，得到aunps-npaoz-mab、aunps-npamoz-mab和aunps-nfs-mab；

14、三，免疫层析系统的制备

15、免疫测定试纸条由5个部分组成：背景板、吸收垫、nc膜、结合垫和样品垫；将npaoz-ova、npamoz-bsa、nfs-ova和gam-igg分别喷涂到nc膜上作为t线和c线，干燥。将eunps-mab或aunps-mab喷在结合垫上，干燥，上述组分经处理后可组装成完整的免疫层析系统；将其切成试纸条，室温下储存备用；

16、四，灵敏度和特异性检测：

17、通过半数最大抑制浓度(ic 50)和检测限(lod)评价eunps-mlfia的灵敏度；

18、使用几种饲料添加剂来评估eunps-mlfia测定的特异性，所述饲料添加剂包括氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素、喹烯酮、喹乙醇、土霉素、红霉素、磺胺甲恶唑、磺胺异恶唑、磺胺嘧啶、无色孔雀石绿色、黄霉素、安普霉素、金霉素、强力霉素、洛美沙星、恩诺沙星和达氟沙星；将这些饲料添加剂标准溶液稀释至100ng/ml进行特异性检测。

19、五，精密度和准确度的性能评价：

20、为了评估eunps-mlfia测定的精确度和准确度，随机选择来自同一批次的五个试纸条用于批内实验，并且随机选择五个不同批次试纸条用于批间实验，均使用阴性样本进行检测。每个测试条重复测试三次，计算变异系数；

21、六，加标回收率实验：

22、将不同浓度的3种标准品加入到鲫鱼、对虾和蛤蜊等阴性样品中，以评估eunps-mlfia的可靠性；在加标实验中，分别以0.1、0.5、1.0ng/ml的npaoz、npamoz和nfs以单独加入或混合在一起的方式加标，计算平均回收率和相对标准偏差(rsd)；

23、七，实际样品分析：

24、采用水产品样品，所述水产品样品包括：草鱼、鲫鱼、石斑鱼、鲈鱼、罗非鱼、鳗鱼、对虾、红虾、蛤蜊、扇贝、大闸蟹。对实际样品进行预处理，采用eunps-mlfia和hplc-ms/ms对水产品样品进行比较；

25、八，数据分析：

26、使用软件分析实验数据并绘制示意图，使用软件绘图，采用受试者工作特征分析对实际样本的结果进行评价。

27、一种同时检测三种硝基呋喃类抗生素的检测模型，包括：

28、一，制备eunps-mab探针：

29、用羧化eunps分别和anti-npaoz-mab、anti-npamoz-mab和anti-nfs-mab制备得到eunps-npaoz-mab、eunps-npamoz-mab和eunps-nfs-mab。

30、二，制备aunps-mab探针：

31、在柠檬酸钠存在下，用氯金酸制备aunps并与mab偶联，得到aunps-npaoz-mab、aunps-npamoz-mab和aunps-nfs-mab；

32、三，免疫层析系统的制备

33、免疫测定试纸条由5个部分组成：背景板、吸收垫、nc膜、结合垫和样品垫；将npaoz-ova、npamoz-bsa、nfs-ova和gam-igg分别喷涂到nc膜上作为t线和c线，干燥。将eunps-mab或aunps-mab喷在结合垫上，干燥，上述组分经处理后可组装成完整的免疫层析系统；将其切成试纸条，室温下储存备用；

34、四，eunps-mlfia参数的优化：

35、对包被抗原与eunps-mab探针的浓度、包被抗原的位置、免疫反应时间和缓冲液的ph值进行了系统优化；

36、五，aunps-mlfia参数的优化：

37、对包被抗原与aunps-mab探针的浓度、包被抗原的位置、免疫反应时间和缓冲液的ph值进行了系统优化；

38、四，灵敏度和特异性检测：

39、通过半数最大抑制浓度(ic 50)和检测限(lod)评价eunps-mlfia的灵敏度；

40、使用几种饲料添加剂来评估eunps-mlfia测定的特异性，所述饲料添加剂包括氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素、喹烯酮、喹乙醇、土霉素、红霉素、磺胺甲恶唑、磺胺异恶唑、磺胺嘧啶、无色孔雀石绿色、黄霉素、安普霉素、金霉素、强力霉素、洛美沙星、恩诺沙星和达氟沙星；将这些饲料添加剂标准溶液稀释至100ng/ml进行特异性检测；

41、五，精密度和准确度的性能评价：

42、为了评估eunps-mlfia测定的精确度和准确度，随机选择来自同一批次的五个试纸条用于批内实验，并且随机选择五个不同批次试纸条用于批间实验，均使用阴性样本进行检测。每个测试条重复测试三次，计算变异系数；

43、六，加标回收率实验：

44、将不同浓度的3种标准品加入到鲫鱼、对虾和蛤蜊等阴性样品中，以评估eunps-mlfia的可靠性；在加标实验中，分别以0.1、0.5、1.0ng/ml的npaoz、npamoz和nfs以单独加入或混合在一起的方式加标，计算平均回收率和相对标准偏差(rsd)；

45、七，实际样品分析：

46、采用水产品样品，所述水产品样品包括：草鱼、鲫鱼、石斑鱼、鲈鱼、罗非鱼、鳗鱼、对虾、红虾、蛤蜊、扇贝、大闸蟹。对实际样品进行预处理，采用eunps-mlfia和hplc-ms/ms对水产品样品进行比较；

47、八，数据分析：

48、使用软件分析实验数据并绘制示意图，使用软件绘图，采用受试者工作特征分析对实际样本的结果进行评价。

49、本发明的有益之处在于：

50、本发明的eunps-mlfia的aoz、amoz和nfs的平均回收率分别为98.0％-104.4％、96.0％-102.6％和98.0％-102.8％。该方法高效液相色谱-串联质谱(hplc-ms/ms)表现出良好的一致性和可行性，具有优秀的可靠性；

51、本发明检测方法可以在10分钟内完成npaoz、npamoz和nfs的分析，结果可以在365nm uv照射下通过肉眼直接观察，通过记录荧光信号，定量npaoz、npamoz和nfs的浓度；npaoz、npamoz和nfs的lod分别为0.013、0.019和0.023ng/ml从，与单目标检测方法相比，该策略大大减少了重复操作，节省了时间；

52、总之，eunps-mlfia将成为检测水产品中nf类抗生素的一种合适的方法，并可应用于其他小分子食品安全和环境污染监测。