一种茶叶中α-淀粉酶抑制剂的高通量筛选方法

文档序号:37262076发布日期:2024-03-12 20:42阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种茶叶中α-淀粉酶抑制剂的高通量筛选方法,其特征在于包括以下步骤:

2.如权利要求1所述的一种茶叶中α-淀粉酶抑制剂的高通量筛选方法,其特征在于步骤1)中,茶叶提取液的制备方法为:取茶粉置于100℃沸水中进行水浸提30min,收集浸提液即为茶叶提取液。

3.如权利要求1所述的一种茶叶中α-淀粉酶抑制剂的高通量筛选方法,其特征在于步骤2)中,α-淀粉酶的固定化的步骤为:

4.如权利要求1所述的一种茶叶中α-淀粉酶抑制剂的高通量筛选方法,其特征在于步骤3)中,茶叶提取液与固定化的α-淀粉酶共同孵育的步骤为:将茶叶提取液和琼脂糖凝胶固定的α-淀粉酶混合,在37℃下以600rpm的转速涡旋20分钟使其孵育,其中,茶叶提取液与琼脂糖凝胶固定的α-淀粉酶的料液比为10:1。

5.如权利要求1所述的一种茶叶中α-淀粉酶抑制剂的高通量筛选方法,其特征在于步骤4)中,移除未与α-淀粉酶结合的化合物的方法为:孵育结束后,静置10分钟,吸出与茶叶提取液相同体积的上清液,再用相同体积的ph 6.8的磷酸盐缓冲液洗涤上述固定化α-淀粉酶的琼脂糖凝胶,洗涤次数为2-6次,以除去未与琼脂糖凝胶结合的茶叶化合物。

6.如权利要求1所述的一种茶叶中α-淀粉酶抑制剂的高通量筛选方法,其特征在于步骤5)中,释放靶点蛋白α-淀粉酶结合底物的方法为:用55%甲醇水溶液,ph 3.3的解析液处理琼脂糖凝胶,以释放捕获的潜在α-淀粉酶抑制剂,然后收集释放的馏分在真空冷冻浓缩仪中进行浓缩,对照组以同样的方式收集洗脱液,其中,解析液的使用量为每次吸出上清液体积的一半。

7.如权利要求1所述的一种茶叶中α-淀粉酶抑制剂的高通量筛选方法,其特征在于步骤6)中化合物筛选及结构鉴定具体为:将步骤5)收集的馏分复溶于10%甲醇水溶液并进行高分辨液质联用分析,筛选出α-淀粉酶组溶液中比对照组溶液中比值>1.5,student’s t-检验p<0.05的化合物,并根据化合物的精确分子量与二级质谱信息进行结构鉴定;上述高分辨液质联用分析所用仪器为uhplc-q-exactive;液相色谱条件为:waters hss t3色谱柱,100×2.1mm,1.8μm,流动相a为0.1%的甲酸溶液,流动相b为含0.1%甲酸的乙腈溶液,流动相梯度设置如下:0分钟,2%b;0.5分钟,2%b;10分钟,15%b;18分钟,40%b;20分钟,90%b;20.9分钟,90%b;21分钟,2%b;25分钟,2%b;流速0.4毫升/分钟,进样量3微升;质谱条件为:采用电喷雾离子源,离子化模式为正离子,毛细管电压为3.5kv,毛细管温度设置为300℃,辅助气温度和流速分别设置为350℃和10升/分钟,扫描范围为质荷比m/z100-1000。

8.如权利要求1所述的一种茶叶中α-淀粉酶抑制剂的高通量筛选方法,其特征在于步骤7)中化合物抑制α-淀粉酶活性测定方法为:对步骤6)筛选出来的化合物,通过购买标样或者从茶叶中分离纯化制备化合物单体,配制成不同浓度的母液,首先吸取0.1ml不同浓度的化合物溶液和0.05mlα-淀粉酶溶液于2ml离心管中,在25℃的水浴锅中孵育10分钟,其次加入0.2ml淀粉溶液后继续在25℃的水浴锅中孵育10分钟,接着再加入0.4ml dns试剂充分混匀,在100℃水浴锅中孵育10分钟,最后再吸取0.1ml反应液至96孔培养板中,用酶标仪在540nm处测量其吸光值,化合物对α-淀粉酶活性的抑制率由以下公式计算:


技术总结
本发明一种茶叶中α‑淀粉酶抑制剂的高通量筛选方法,包括以下几个步骤:1)茶叶提取液的制备;2)α‑淀粉酶的固定化;3)茶叶提取液与固定化的α‑淀粉酶进行共同孵育;4)移除未与α‑淀粉酶结合的化合物;5)释放靶点蛋白α‑淀粉酶结合底物;6)化合物筛选及结构鉴定;7)化合物抑制α‑淀粉酶活性测定。本发明通过直接利用茶叶提取液与α‑淀粉酶进行孵育,筛选具有α‑淀粉酶抑制能力的活性化合物,无需茶叶中化合物单体的分离纯化步骤,节省工作量的同时还能直接筛选出对于α‑淀粉酶具有较强结合能力的活性化合物,具有操作简单、快速、高效、成本低的优点,在茶叶活性成分的筛选研究领域具有广阔的应用前景。

技术研发人员:戴伟东,高健健,林智,王哲,周梦雪,郭丽,朱荫
受保护的技术使用者:中国农业科学院茶叶研究所
技术研发日:
技术公布日:2024/3/11
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