枣花蜂蜜的鉴别方法与应用与流程

本发明涉及蜂蜜检测，具体地说，涉及枣花蜂蜜的鉴别方法与应用。

背景技术：

1、枣为鼠李科枣属植物，是主要的蜜源植物之一，分布广泛，主要产地有山西省、山东省、河北省、新疆维吾尔自治区、陕西省，开花时间一般为6-7月，花期持续25-30天。枣花蜜味道独特，不易结晶，富含活性成分，具有药用价值，一直以来深受消费者的青睐。但近年来，枣花蜜在市场上存在严重掺假现象，制约了枣花蜜产业特色经济的发展。因此，建立一套鉴别枣花蜜真假的方法是十分必要和迫切的。

2、溃疡性结肠炎是一种病因尚不明确的慢性非特异性肠道炎性病变，发病急且病程长，发病率逐年递增。目前，溃疡性结肠炎的治疗主要在于抑制肠道炎症，如现有的氨基水杨酸药物(美沙拉嗪、巴柳氮、奥沙拉嗪)、糖皮质激素、免疫抑制剂及生物制剂等，但很多患有中度至重度溃疡性结肠炎的患者出现应答不足，疗效不佳，停药后易复发等现象。因此，寻找疗效高且副作用低的溃疡性结肠炎新药物仍然是必要的。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种鉴别枣花蜜的方法及其在抗溃疡性结肠炎中的应用。

2、为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

3、一种枣花蜂蜜的鉴别方法，当待测蜂蜜中，同时包含4-羟基喹啉、4-羟基-8-甲氧基喹啉、吐叶醇、2-羟基喹啉、3-吲哚甲醛、柃木素a、柃木素b、红花菜豆酸、反,反-脱落酸、顺,反-脱落酸、顺,顺,顺-三-对-香豆酰亚精胺、顺,顺,反-三-对-香豆酰亚精胺、顺,反,顺-三-对-香豆酰亚精胺和反,反,反-三-对-香豆酰亚精胺时，则判定所述待测蜂蜜为枣花蜂蜜。

4、本发明将枣花蜂蜜与洋槐蜜、紫椴蜜、荆条蜜、油菜蜜四种大宗单花蜜的hplc图谱的比较，以及对收集的其他小众蜂蜜如红花蜜、五倍子蜜、鹅掌柴蜜、枸杞蜜、九龙藤蜜等的植物化合物的分析对比，均未在枣花蜂蜜以外的其他单花蜜中同时检测出化合物4-羟基喹啉、4-羟基-8-甲氧基喹啉、吐叶醇、2-羟基喹啉、3-吲哚甲醛、柃木素a、柃木素b、红花菜豆酸、反,反-脱落酸、顺,反-脱落酸、顺,顺,顺-三-对-香豆酰亚精胺、顺,顺,反-三-对-香豆酰亚精胺、顺,反,顺-三-对-香豆酰亚精胺、反,反,反-三-对-香豆酰亚精胺。且多产地批次的枣花蜂蜜中均同时检测到上述14种化合物，这证明了这14种成分可作为枣花蜂蜜的特征性植物化合物标记物。

5、本发明鉴别方法中，当所述待测蜂蜜中，4-羟基喹啉的含量为0.13～0.97mg/kg，4-羟基-8-甲氧基喹啉的含量为0.65～2.25mg/kg，吐叶醇的含量为4.50～18.25mg/kg，2-羟基喹啉的含量为0.42～1.71mg/kg，3-吲哚甲醛的含量为1.34～2.48mg/kg，柃木素a的含量为0.10～0.60mg/kg，柃木素b含量为0.15～1.27mg/kg，红花菜豆酸的含量为0.35～5.43mg/kg，反,反-脱落酸的含量为0.11～0.97mg/kg，顺,反-脱落酸的含量为0.49～1.65mg/kg，顺,顺,顺-三-对-香豆酰亚精胺的含量为0.32～0.95mg/kg，顺,顺,反-三-对-香豆酰亚精胺的含量为0.27～1.32mg/kg，顺,反,顺-三-对-香豆酰亚精胺的含量为0.30～1.16mg/kg，反,反,反-三-对-香豆酰亚精胺的含量为0.22～1.51mg/kg时，则判定所述待测蜂蜜为枣花蜂蜜。

6、本发明鉴别方法中，通过高效液相色谱法对所述待测蜂蜜中是否存在4-羟基喹啉、4-羟基-8-甲氧基喹啉、吐叶醇、2-羟基喹啉、3-吲哚甲醛、柃木素a、柃木素b、红花菜豆酸、反,反-脱落酸、顺,反-脱落酸、顺,顺,顺-三-对-香豆酰亚精胺、顺,顺,反-三-对-香豆酰亚精胺、顺,反,顺-三-对-香豆酰亚精胺和反,反,反-三-对-香豆酰亚精胺进行检测；

7、进行高效液相色谱检测时，流动相a为浓度为0.18-0.22％的乙酸的水溶液，流动相b为浓度为0.18-0.22％的乙酸的甲醇溶液；

8、梯度洗脱程序为：0～15min内，流动相b由3％上升至5％；15～25min内，流动相b由5％上升至9％；25～35min内，流动相b由9％上升至12％；35～45min内，流动相b由12％上升至15％；45～55min内，流动相b由15％上升至18％；55～65min内，流动相b由18％上升至19％；65～75min内，流动相b由19％上升至20％；75～85min内，流动相b由20％上升至21％；85～120min内，流动相b由21％上升至45％；120～140min内，流动相b由45％上升至54％；140～160min内，流动相b由54％上升至80％；

9、色谱柱为phenomenex gemini c18色谱柱。

10、流动相a随流动相b的体积变化而变化，流动相a和b两者体积加和始终为100％。

11、本发明鉴别方法中，进行高效液相色谱检测时，流速为0.6-0.8ml/min，进样量为20μl，柱温为35±1℃，检测波长为260nm。

12、优选，流动相a为浓度为0.2％的乙酸的水溶液，流动相b为浓度为0.2％的乙酸的甲醇溶液；流速为0.7ml/min，柱温为35℃。

13、本发明鉴别方法中，在进行高效液相色谱检测前，还包括以固相萃取柱对待测蜂蜜中的特征性成分进行提取的步骤；具体采用strata-x-a固相萃取柱提取，以甲醇作为活化剂、水作为平衡剂和淋洗剂，以浓度为9-11％的甲酸的甲醇溶液作为洗脱剂，最后将获得的洗脱液吹干，以甲醇复溶后，过滤备用。

14、过滤时滤膜的孔径为0.22μm；优选，洗脱剂为浓度为10％的甲酸的甲醇溶液。

15、上述提取方法，可有效去除枣花蜜中的干扰成分，实现目标组分的有效富集。

16、本发明鉴别方法中，在以固相萃取柱对待测蜂蜜中的特征性成分进行提取前，还包括待测蜂蜜的预处理步骤，具体包括：将所述待测蜂蜜与水混合后，调节ph值为6.5-7，8800-9200rpm离心18-22min后，取上清液备用。

17、优选，调节ph值为6.8，9000rpm离心20min。

18、本发明中预处理加入水的量以可充分溶解蜂蜜，并利于后续操作为宜。

19、本发明还提供上述鉴别方法在判别枣花蜂蜜真伪中的应用。

20、本发明另提供一种枣花蜂蜜的指纹图谱，其通过高效液相色谱法对枣花蜂蜜进行处理构建得到，所述高效液相色谱法如上所述。

21、优选，通过上述蜂蜜预处理、以固相萃取柱对蜂蜜中的特征性成分进行提取和高效液相色谱检测三步骤构建获得。

22、本发明建立了枣花蜂蜜中特征性成分的固相萃取提取及高效液相色谱分离检测方法，并通过hpcl-qtof方法，共鉴定出枣花蜂蜜中含有的有代表性的14种植物化合物。将获得的枣花蜜植物化合物hplc图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，初步模拟生成了具有代表意义的枣花蜂蜜标准指纹图谱。

23、本发明还提供上述鉴别方法在制备治疗抗溃疡性结肠炎药物中的应用。

24、本发明的应用中，在进行治疗抗溃疡性结肠炎药物制备前，先对枣花蜂蜜的真实性进行鉴别。

25、本发明通过构建dss诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型，评价了枣花蜜对溃疡性结肠炎小鼠的抗炎作用。发现枣花蜜具有缓解肠粘膜炎症、维护肠粘膜屏障功能，在dss诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中展现良好的治疗效果，对未来新型结肠炎药物的开发研究具有重要意义。具体给予dss诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠灌喂枣花蜜后，能够显著减缓小鼠体重下降、降低疾病活动指数、减少炎症细胞因子水平。

26、当以本发明鉴别方法对原料进行真伪判定后，再进行相关产品的制备，可更有利于工业化生产。

27、本发明的有益效果至少在于：

28、本发明发现了一种新的用于枣花蜜真实性及品质评价的方法，其可有效区分枣花蜂蜜和其他植物源蜂蜜，对保护蜂蜜消费者的合法权益和维护蜂蜜消费行业的健康发展具有重要现实意义。且该方法结果可靠稳定、成本较低、简单易行，还可为新型溃疡性结肠炎药物的开发研究做出贡献。