帕金森病患者外周血标记物及其应用的制作方法

本发明属于诊断领域，具体涉及帕金森病患者外周血标记物及其应用。

背景技术：

1、帕金森病(parkinson’s disease，pd)是一种慢性、缓慢进展的神经性病，与黑质多巴胺神经元的进行性退发有关。与在成年大脑纹状体多巴胺水平及其代谢下降有关。受影响的病人经历运动功能损害：包括震颤，肌肉强硬，运动迟缓伴随其他症状包括痴呆，抑郁，失眠及嗅觉丧失anosmia 。导致pd的因素包括神经感染，不适当的凋亡与自噬，基因突变，神经营养缺陷(neurotrophic support failure)及氧化应激压力，特别是后者。由于多巴胺神经元对氧化代谢物（ros,氧自由基） 过多蓄积特别容易受到影响，过多蓄积是来自于黑质中多巴胺代谢，线粒体功能失调，神经感染，铁蓄积。

2、帕金森病的主要特征是多巴胺神经元的丢失。皮质纹体直接通路神经元突触的功能失调，五羟色胺终端多巴胺释放的异常，氮氧化物水平的失调，神经感染，细胞外信号通路调节酶的过度反应，都与左旋多巴诱导的运动障碍(levodopa-induced dyskinesia，lid)相关。上述影响各因素的措施都可能是治疗lid的手段。各种因素又可互相影响。不同的因素显示神经炎症，及与神经炎症相关的血管紧张素，炎症前细胞因子特别是il-1β的释放，诱导血脑屏障渗透性的变化，促进lid产生及发展。抗炎因子就成为治疗lid的一个潜在手段。研究表明阻塞炎症因子机制的化合物能减少6-ohda鼠模型的lid。

3、也有研究观察到血管紧张素1型受体拮抗剂cantesartan减少lid。at-1是肾素-血管紧张素系统(ras)的主要的助（强化）氧化/及助感染轴。

4、血管紧张素ii，经at1受体，活化nadph-oxidase复合物，此为继线粒体细胞内超氧化物的第二个最主要来源。如果不被ras 抗氧化轴适当对抗，会导致氧化压力过大及炎症。血管紧张素ii/at1/nadph氧化酶/超氧化物轴的活动诱化rho-kinase（rock）活动，在ras促炎症效应中起重要作用。ati受体激动剂及rock活动相互作用调节神经炎症反应，血管形成，血脑屏障通透性。最近观察到法舒地尔这样的rock抑制剂有减缓运动失常的潜在作用。法舒地尔减少了l-dopa诱导的运动失常发展，抑制已经产生的运动失常，而不影响l-dopa的治疗作用。他汀抑制胆固醇合成过程中的效力酶的作用，他汀也能抑制ras-erk途径，此路径与运动失调有关。从而治疗lid。在鼠和猴模型，他汀同时减少lid及erk1/2的磷酸化，他汀的效应可能被at1及rock抑制调节。at1及rock抑制剂可能代替或提高他汀的作用，从而减少他汀抑制lid的剂量及从而减少副作用。还不能确定的是他汀导致脑内胆固醇的减少及可能的抗炎作用是否在抗lid中起作用。有必要调查at1及rock途径活动是否调节他汀的抗运动失调作用及对抗运动失调治疗策略的可能的影响。

5、认知缺乏是帕金森病常见的非运动症状，认知缺陷常常是帕金森病的非运动症状，病理状态不清楚。病理过程尚不清楚。最近的研究表明：可能牵涉到胰岛素抵抗，和谷氨酸兴奋性中毒。

6、cd146的基因为单拷贝基因，位于人11号染色体长臂上，跨越大约14,000bp的染色体区域，编码一个相对分子质量为11.3kda的糖基化蛋白。不同物种（人、小鼠和鸡）中cd146基因的外显子-内含子结构相似 。mrna全长包含16个外显子，hcd146的第一个外显子编码区包括5’utr端的26bp和超过三分之一的信号肽。第一个可变区（variable region）和三个c-2恒定区由两个外显子编码。第二个可变区由三个外显子编码。第16个外显子包含了1kb长的5’-utr编码区。cd146基因含有三个poly(a)信号。hcd146的tata-和caat-box-less核心启动子区起始于第一个atg上游的第505bp氨基酸，富含gc并且包含转录因子sp1、ap-2和creb共识别的几个结合基序。由于转录因子ap-2在胚胎发育中是至关重要，而cd146启动子区域含有多个ap-2结合位点，这也暗示cd146在发育过程中可能会通过ap-2使其转录水平上调。

7、不同物种间的cd146蛋白序列具有高度的统一性。成熟的cd146蛋白包括一个胞外区、一个跨膜区和胞质尾区3部分。其胞外区含有特征性的免疫球蛋白结构域，包括2个可变区和3个恒定区(v-v-c2-c2-c2)。其胞质尾区含有潜在的蛋白激酶识别部位，cd146活化后，可通过其胞质区与p59fyn形成复合物。p59fyn作为src家族激酶，促使酪氨酸激酶p125pak磷酸化并增强其与桩蛋白(paxillon)的联系。

8、c146又被称为mcam。mcam通常是作为层黏连单板α4的受体起作用，是血管壁中普遍存在的基质分子。也就是所说，mcam可在血管壁组分细胞中高表达，包括血管内皮细胞、平滑肌细胞和周细胞。mcam作为黏附分子中的一员，通过与其配体相互作用，介导细胞间及细胞与基质间的作用是黏附分子的基本功能特征。在cd146结构部分已经介绍，cd146活化后，可通过其胞质区与p59fyn形成复合物。活化的p59fyn可进一步引起酪氨酸激酶p125pak磷酸化并与桩蛋白(paxillon)结合，这也表明cd146可通过其胞内结构域对细胞外到细胞内的信号进行传导和交流，有助于局部黏连聚集、细胞骨架重组、维持细胞结构和调节细胞的功能。

9、cd146除了具有黏附分子特性，最近的研究表明cd146在多种细胞生理过程中表现活跃，包括发育、信号转导、细胞迁移、间充质干细胞分化、血管生成和免疫应答。其中，目前研究最多的是参与肿瘤的血管形成和转移。肿瘤的生长和扩散转移与其微血管生成和数量增加密切相关，无论是原发肿瘤还是转移肿瘤在生长扩散过程中都依赖血管生成。正常状态下，血管生成会处于平衡状态。这种平衡在肿瘤微环境中会被打破。目前，cd146调节肿瘤血管形成的机制可能包括激活基质金属蛋白酶2(mmp-2)，该酶可降解基底膜和细胞外基质，激活生长因子，主要是血管内皮细胞生长因子(vegf)，有利于肿瘤转移和肿瘤血管形成。

10、cd146除了在细胞-细胞粘附中起作用外，cd146还参与内皮细胞外信号向胞内的信号传导，并参与肌动蛋白细胞骨架重排。这里，我们罗列了几条与cd146功能相关的信号通路。

11、cd146通过其胞内区p59fyn（src家族激酶）结合而启动蛋白激酶磷酸化级联反应。活化后的p59fyn会磷酸化pkc-γ的下游激酶，下游激酶的磷酸化会触发细胞内的ca2+释放。这会进一步活化并诱导p130、pyk2和桩蛋白的磷酸化及结合，同时促进p125fak的活化，这一系列的反应会促进肌动蛋白的极化作用。这条cd146介导的信号通路解释了cd146促进正常细胞运动并通过将外部信号传递给下游信号蛋白进行细胞骨架重塑来增加肿瘤细胞侵袭性的机制。过表达的cd146可通过下调atf-3来上调id-1，atf-3是id-1的转录抑制因子。但有关于cd146上调id-1表达是存在于所有恶性肿瘤中还是仅限于黑素瘤目前尚不清楚。

12、已有多项研究报道cd146是肿瘤血管生成的新靶点。这一结论引发了肿瘤研究者们对cd146诱导血管生成潜在机制的积极探索。相关研究表明，在cd146介导的信号通路中，cd146会在细胞表面形成cd146-cd146二聚体。过表达的cd146通过上调转录因子slug来增强emt。转录因子slug可控制多个emt相关元件（如mmp-9）的转录。另外，除了作用于slug，cd146还可以作为vegf配体的共同受体与vegfr-2结合，增强vegfr / nfκb信号传导。这个机制的发现为cd146在癌症转移中的关键作用进一步提供了明确的证据。

13、cd146 还广泛存在于多种组织及肿瘤。如表达于中间型滋养细胞，可与其他抗体联合，用于滋养细胞肿瘤的鉴别。cd146是一种ca2+非依赖性细胞黏附分子的膜糖蛋白，该蛋白首次鉴定为肿瘤标志物是因为cd146在黑素瘤中高表达，但在对应的正常对照组中却没有。正是这一发现让cd146受到了肿瘤研究领域的关注。

14、目前，大量研究已证实cd146在黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、尿路上皮癌和妇科肿瘤中表达并与这些肿瘤的发生发展、转移、治疗和预后密切相关。未有研究表明cd146与pd相关。

15、参考文献：

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技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种帕金森病患者外周血标记物及其应用。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一个方面，提供：

4、定量cd146表达量的试剂在制备帕金森病诊断试剂中的应用。

5、在一些应用的实例中，试剂检测的样本为外周血样本。

6、在一些应用的实例中，定量cd146表达量的试剂选自elisa试剂、western blot分析试剂、免疫荧光检测试剂。

7、本发明的第二个方面，提供：

8、一种诊断或筛查帕金森病的系统，包括：

9、样本分析装置，用于确定样本中cd146的表达量；

10、分析装置，根据样本中cd146的表达量，确定受试者患有帕金森病的风险；

11、结果输出装置，输出分析装置的分析结果。

12、在一些诊断或筛查帕金森病的系统的实例中，所述样本为外周血样本。

13、在一些诊断或筛查帕金森病的系统的实例中，样本分析装置选自elisa分析装置、western blot分析装置、免疫荧光分析装置中的一种。

14、在一些诊断或筛查帕金森病的系统的实例中，cd146的表达量超出正常人表达量均值+2个标准差，判定为帕金森病高风险。

15、在一些诊断或筛查帕金森病的系统的实例中，cd146的表达量高于0.30ug/l，判定为帕金森病高风险。

16、在一些诊断或筛查帕金森病的系统的实例中，通过绘制roc曲线确定受试者患有帕金森病的风险。

17、在一些诊断或筛查帕金森病的系统的实例中，正常人的样本量不少于30，入选正常人的年龄不小于40岁。

18、本发明的有益效果是：

19、发明人研究发现，基于外周血cd146可以很好地预测帕金森病，可以很好地应用于帕金森病的诊断或早期筛查。外周血样本易于获得，大幅降低了帕金森病筛查和/或诊断的成本。