一种生物样本中水溶性维生素、激素、核苷类、有机酸和氨基酸的检测方法与流程

本发明涉及生物样本检测，尤其涉及一种生物样本中水溶性维生素、激素、核苷类、有机酸和氨基酸的检测方法。

背景技术：

1、临床常见的生物样本包括血清、血浆、全血、尿液、乳汁和唾液等，其基质组成非常复杂，样本中既含有蛋白质、核酸等大分子物质，还有糖、脂肪和盐等小分子物质，都可能对分析检测产生干扰；生物样本中的水溶性维生素、激素、核苷、有机酸和氨基酸等小分子是生命体中重要的营养物质，对生理功能和临床诊断具有重要作用。

2、水溶性维生素是一类能溶于水的有机营养分子，常是辅酶或辅基的组成部分，包括在酶的催化中起着重要作用的b族维生素。其中，核黄素即b2是体内许多重要辅酶类的组成成分，它还是蛋白质、糖、脂肪酸代谢和能量利用与组成所必需的物质，b2能促进生长发育，保护眼睛和皮肤的健康。此外，因维生素b12的检测方法灵敏度低使得临床检测难度大，而甲基丙二酸(mma)是维生素b12缺乏的功能性生物标志物，同时也可用于检测甲基丙二酸血症。

3、类固醇激素是由胆固醇经一系列酶催化而来的一类非极性的小分子激素，是身体发育、性成熟以及新陈代谢所必需的。类固醇激素的检测有助于诊断内分泌紊乱的相关疾病，比如库欣综合征是一种与皮质醇(f)相关的疾病，而雄烯二酮(ad)、睾酮(t)和硫酸脱氢表雄酮(dheas)可用于诊断雄激素过多症。

4、核苷是一类具有广泛生理活性的水溶性生物分子，在人体内具有重要的生理功能，它能够提供细胞能量、参与dna和rna合成、抗氧化、调节免疫和细胞活动等作用。rna代谢可产生核苷和修饰核苷，尿液中修饰核苷的排量可以反应机体细胞的代谢速度，而肿瘤细胞较正常细胞增值快，导致尿液中修饰核苷的含量升高。研究表明：在乳腺癌患者中胞苷、3-甲基胞苷和肌苷这3种修饰核苷显著升高。因此，尿液修饰核苷目前已成为被公认的一类癌症生物标志物。而另一类癌症生物标志物就是尿液中蝶呤衍生物，研究表明，源于三磷酸鸟苷的生物蝶呤和新蝶呤及其中间体的喋啶在血管舒张、感染、自身免疫性疾病和癌症中起重要作用；患有上皮肿瘤(包括膀胱癌、乳腺癌、肺癌、消化道癌和脑癌)患者的尿液中多种叶酸喋啶衍生物，如6-羧蝶呤、蝶呤和异黄蝶呤的水平有所升高。

5、氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物，是组成酶和蛋白质的基本单位，机体游离氨基酸对生理功能和临床诊断具有重要作用。有机酸是指一些具有酸性的有机化合物，是身体代谢产生的一大类化合物，具有抑菌、消炎、抗病毒、抗突变、抗癌等作用，可以作为代谢异常的一个重要诊断指标。

6、以上5类小分子化合物的极性差异大，而且在不同基质中的含量差异也较大，目前还未有报道可以同时检测不同生物样本中水溶性维生素、激素、核苷、有机酸和氨基酸的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种生物样本中水溶性维生素、激素、核苷类、有机酸和氨基酸的检测方法。本发明提供的方法可以同时检测生物样本中的水溶性维生素、激素、核苷、有机酸和氨基酸。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了一种生物样本中水溶性维生素、激素、核苷类、有机酸和氨基酸的检测方法，包括以下步骤：

3、将生物样本和内标物混合后，除杂，得到待测样品液；

4、对所述待测样品液进行高效液相色谱串联质谱检测，得到各待测物的峰面积；所述待测物包括水溶性维生素、激素、核苷类、有机酸和氨基酸中的一种或几种；

5、根据待测物的峰面积和预定的标准曲线，得到待测物的浓度；所述预定的标准曲线为待测物峰面积和浓度的线性关系；

6、高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系为流动相a和流动相b，所述流动相b为甲醇，所述流动相a为乙酸铵水溶液和甲酸；

7、所述流动相体系的流速为0.25ml/min；洗脱方式为梯度洗脱；

8、所述质谱检测的条件包括：电喷雾离子源；多反应监测：mrm模式。

9、优选地，所述梯度洗脱的程序为：

10、0.0～2.5min：所述流动相a的体积百分含量为100％；

11、2.5～3.0min：所述流动相a的体积百分含量由100％匀速减少到90％；

12、3.0～6.0min：所述流动相a的体积百分含量由90％匀速减少到80％；

13、6.0～7.0min：所述流动相a的体积百分含量由80％匀速减少到30％；

14、7.0～12.0min：所述流动相a的体积百分含量由30％匀速减少到2％；

15、12.0～12.1min：所述流动相a的体积百分含量由2％匀速增加到100％；

16、12.1～15.0min：所述流动相a的体积百分含量为100％。

17、优选地，所述高效液相色谱检测的色谱柱为waters acquity uplc hss t3柱；柱温为40℃；进样量为1μl；所述质谱检测的雾化器压力：45psi；干燥气温度：300℃；干燥气流速：10l/min；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11l/min。

18、优选地，所述流动相a中乙酸铵水溶液的浓度为0.4mmol/l，所述流动相a中甲酸的体积浓度为0.1％。

19、优选地，所述生物样本为人血清、尿液、乳汁和唾液样本中的一种或几种。

20、优选地，所述水溶性维生素包括甲基丙二酸、维生素b3、烟酸、维生素b6、维生素b5、维生素b7、维生素b1、维生素b2和5-甲基四氢叶酸中的一种或几种；

21、所述激素包括雄烯二酮、睾酮、可的松、皮质醇和硫酸脱氢表雄酮中的一种或几种。

22、所述核苷类包括2-氨基-4-羟基蝶呤、2,4-二羟基蝶啶、异黄蝶呤、喋呤-6-羧酸、l-墨蝶呤、生物喋呤、胞苷、尿苷、假尿苷、新蝶呤、5-甲基尿甙、p-氨基苯甲酰谷氨酸、腺苷、肌苷、鸟苷、8-羟基脱氧鸟嘌呤和黄嘌呤核苷中的一种或几种。

23、所述有机酸包括α-羟基丁酸、琥珀酸、β-羟基异戊酸、焦谷氨酸、乙基丙二酸、4-羟基苯甲酸、己二酸、苯基乙醛酸、4-羟苯基乙酸、羟甲基戊二酸、顺式乌头酸、吲哚乙酸、马尿酸、高香草酸、犬尿喹啉酸、柠檬酸、5-羟基吲哚乙酸、葡萄糖酸和香草基扁桃酸中的一种或几种。

24、所述氨基酸包括丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、牛磺酸、同型脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸、犬尿氨酸、甘氨酸和胱氨酸中的一种或几种。

25、优选地，所述除杂为将生物样本和内标物混合所得混合液与蛋白沉淀剂混合，依次进行蛋白沉淀、离心；所得上清液浓缩至干后复溶，所得复溶液依次进行沉淀和离心，得到待测样品液。

26、优选地，所述蛋白沉淀剂为甲醇、甲醇-乙腈体系或甲醇-乙腈-甲酸体系。

27、优选地，所述甲醇-乙腈体系中甲醇和乙腈的体积比为2:1；所述甲醇-乙腈-甲酸体系中甲醇和乙腈的体积比为4:3。

28、优选地，所述内标物为水溶性维生素、激素、核苷类、有机酸和氨基酸的同位素内标物。

29、本发明提供了一种生物样本中水溶性维生素、激素、核苷类、有机酸和氨基酸的检测方法，包括以下步骤：将生物样本和内标物混合后，除杂，得到待测样品液；对所述待测样品液进行高效液相色谱串联质谱检测，得到各待测物的峰面积；所述待测物包括水溶性维生素、激素、核苷类、有机酸和氨基酸中的一种或几种；根据待测物的峰面积和预定的标准曲线，得到待测物的浓度；所述预定的标准曲线为待测物峰面积和浓度的线性关系；高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系为流动相a和流动相b，所述流动相b为甲醇，所述流动相a为乙酸铵水溶液和甲酸；所述流动相体系的流速为0.25ml/min；洗脱方式为梯度洗脱；所述质谱检测的条件包括：电喷雾离子源；多反应监测：mrm模式。本发明样本经除杂后，利用高效液相色谱将目标待测物与不同基质中的干扰组分进行分离，再通过质谱仪检测目标待测物与其对应同位素内标的质荷比(m/z)的响应，最后使用内标法定量，得到目标物的含量。实施例的数据表明：本发明提供的方法通量高、特异性强且灵敏度高，具有较宽的线性范围，15分钟内可同时检测68种化合物，各基质的批内批间和准确度均在85％-115％，满足美国临床实验室标准协会clsi c62-a的相关要求，为临床生物样本的快速筛查提供了参考。