过氧化氢快速检测试剂盒及使用方法与流程

本技术涉及过氧化氢检测，具体为一种过氧化氢快速检测试剂盒及使用方法。

背景技术：

1、过氧化氢是一种具强氧化性的小分子化合物，易溶于水，在常温弱酸至中性和生理条件下比较稳定。人体内的过氧化氢由细胞代谢过程中产生的超氧负离子自身歧化或经超氧化物歧化酶催化生成，并可以跨膜扩散进入到组织和体液中。在正常生理状态下，体内的过氧化氢在过氧化氢酶的催化下转化为水而被快速清除，使得过氧化氢被控制在很低水平。大量研究发现，cat在肺癌、食管癌、肠癌、肝癌、宫颈癌等多种实体瘤组织中表达下调和活性显著降低，导致细胞和组织内的过氧化氢积累增加，形成氧化压力，引起dna、蛋白质、脂质等生物大分子物质氧化损伤和基因组不稳定性增加，传递促肿瘤生长信号，是促进肿瘤发生和发展的重要机制。实体瘤生长所需的营养若仅来源于周围组织的弥散扩散，其生长极为缓慢或处于休眠状态，肿瘤大小停留在1-2mm左右，其突破生长发展限制，需生成肿瘤血管，从血液供应中不断摄取营养物质，并运走代谢物质。过氧化氢的高扩散性，使得肿瘤在血管生成之前就可以释放过氧化氢进行生长信号传播。研究证实，过氧化氢可激活细胞低氧诱导因子1，继而引发血管内皮生长因子等一系列促进血管生成的蛋白质表达上调，引导血管生成通入到肿瘤内。通过对蛋白质中半胱氨酸巯基的氧化，过氧化氢还可直接或间接活化egfr、pkc、mapk、cdk、jak、ras、nf-κb、c-myc、ap-1等促进肿瘤发生发展的信号传导蛋白，抑制pten、ptps等具有抑癌功能的磷酸酶的活性，使得促癌信号路径更加持续促进肿瘤发生发展，并可导致肿瘤细胞对化疗药物和egfr等靶向药物的抗性。因此，对人体来源样本中过氧化氢的检测不仅可用于肿瘤早筛，还可用于肿瘤治疗和预后的跟踪监测。另外，过氧化氢检测还是妇科炎症检查的常用手段。发展可便利自测的过氧化氢检测手段，有利于关注自身健康的女性进行自我检查和监测。

2、过氧化氢检测的常见方法主要基于过氧化氢的强氧化性，具体包括比色(吸光度)法、荧光法、电化学传感器法等。这些方法需要进行样本采集、液化裂解去除杂质、混合反应等一系列专业操作处理，易造成过氧化氢的降解丢失，样本溶液中的金属离子、亚硝酸盐、蛋白质、溶解氧、空气中的氧气，易造成样本和试剂的变质和干扰检测，因此，这些方法通常需要试剂现配现用或低温暂存限时使用，这不能很好地满足即时快检的便利性和成本控制的需求。气道呼出气检测基于电化学传感器法，不需要专门取样，但由于过氧化氢挥发性很低，这种测试过程依赖于专业设备设施和专业操作指导质控，灵敏度和特异性有限，干扰因素多、性能波动大，还需要进行专门的消毒步骤以避免交叉污染；受试者的理解配合程度、口腔压力、肺体积、呼出气体流速波动、仪器型号厂家等因素都会造成存在较大差异，也不利于poct和普及应用。在申请号为202211539935.8的一种气道过氧化氢检测方法及试剂盒中提供了过氧化氢定性便利检测的体系和方法，但仍然存在一部分人群难以咳出样本而一部分人群样本又过于粘稠难以处理等取样和处理过程易受干扰的缺陷，不利于普遍应用，同时，体系的生产保质也需要进一步地加强改进。由于肿瘤早期症状很不明显或无症状，肿瘤早筛检测需要很强的便利易用性和成本控制以适配居家/社区监测等普及应用场景，需要开发便利易用且便于组装生产和长期保质贮存备用成本可控的过氧化氢检测技术和产品。

3、申请内容

4、本技术的目的在于提供一种过氧化氢快速检测试剂盒及使用方法，可以快速溶解和检测样本中的过氧化氢，能够直观准确地定性判定样本中源于病变而分泌积累的过氧化氢。

5、为实现上述目的，本技术提供如下技术方案：一种过氧化氢快速检测试剂盒，包括样本稀释液和干燥有检测显色剂以及质控显色剂的试纸条，所述样本稀释液包括100-500mm草酸铵、0.3-2.0mm 8-羟基喹啉、50-500mm氯化钠以及10－100mm ph4.5-7.0的第一ph调节剂。

6、优选的，第一ph调节剂为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙酸钠或2-(n--吗啉)乙磺酸(mes)的至少一种。

7、优选的，检测显色剂包括2.0％-8.0％(w/v)淀粉、0.5-5.0mm乙酸、0.5％-2.0％(w/v)聚氧乙烯月桂醚(brij-35)、1.0-7.0m碘化钾、2.0-10.0mm8-羟基喹啉、50-300mm氯化钙、5-100mm第二ph调节剂以及3-15mm l-抗坏血酸或硫代硫酸钠。

8、优选的，第二ph调节剂包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙酸钠、碳酸氢钠或三羟甲基氨基甲烷(tris)中的至少一种。

9、优选的，质控显色剂包括5-30mm中性红以及10-60mm碳酸氢钠。

10、优选的，试纸条上燥有中间线试剂，中间线试剂包括5％-15％(w/v)brij-35以及5％-15％(w/v)十二烷基硫酸钠(sds)。

11、优选的，过氧化氢快速检测试剂盒包括样本稀释液和干燥有检测显色剂、中间线试剂以及质控显色剂的试纸条，

12、所述样本稀释液包括500mm草酸铵、2mm8-羟基喹啉、450mm氯化钠、20mm ph6.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠；

13、所述试纸条尺寸为68mm×6mm×0.7mm，试纸条右端干燥有3μl的检测显色剂，检测显色剂包括2％(w/v)淀粉、1mm乙酸、250mm氯化钙、2％(w/v)brij-35、2m碘化钾、5mm 8-羟基喹啉、15mm硫代硫酸钠以及10mm碳酸氢钠；在试纸条的检测显色剂左侧干燥有3μl的中间线试剂，中间线试剂包括10％(w/v)brij-35和10％(w/v)sds；在试纸条的中间线试剂左侧干燥有3μl的质控显色剂，质控显色剂包括15mm中性红以及45mm碳酸氢钠。

14、本技术还提供一种过氧化氢快速检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

15、步骤一：取待检样本加入到如权利要求1-7任一所述的样本稀释液中得到混合液一；

16、步骤二：将混合液一移液至如权利要求1-7任一所述的干燥有检测显色剂、中间线试剂以及质控显色剂的试纸条的加样区静置等待试纸条显色。

17、优选的，步骤一具体包括：以咽拭子采样器取样后，将取样端浸入到内置如权利要求1-7任一所述的样本稀释液的采样管内，沿着刻痕折断，把取样端留置在管内，封紧采样管，摇晃采样管使得取样端完全浸入在样本稀释液中得到混合液一。

18、优选的，步骤二具体包括：将混合液一滴入至试纸条的加样区，静置至质控显色剂区域充分变色显示紫红色，观察检测显色剂区域显色，等待时间不超过3分钟，检测显色剂区域显示蓝黑色为阳性结果，指示过氧化氢含量达到或超过检测阈值；检测显色剂区域没有显色或颜色微弱为阴性结果，指示过氧化氢含量低于检测阈值。

19、优选的，以咽拭子采样器取样时，对于可以直接接触的取样部位，用户可直接以咽试子采样器擦拭取样部位取样；对于气道粘液检测，用户在漱口清洁口腔后，喝一口水，拍打前胸或后背10次，深呼吸，用力咳漱6次，促使少量气道粘液从气道排出并聚集到口腔内，再以咽试子采样器插入口中舌上后端，闭嘴含住约3秒取样。

20、优选的，咽拭子采样器为新冠核酸检测一次性使用无菌采样拭子，拭子柄材料使用空心聚苯乙烯(ps)、聚丙烯(pp)或abs塑料制造，取样端采样拭子头使用pe合成纤维、聚酯纤维、聚丙烯纤维、人造纤维等合成纤维制造；一次取样量约100mg±15mg或100μl±15μl。

21、优选的，样本稀释液可以置于能充分容纳采样器取样端的采样管中，包括但不限于常用的聚丙烯材质的螺帽管或聚乙烯材质的滴管中。

22、优选的，试纸条的干燥工艺为：50℃±10℃的烘箱或空气流通的温箱内，避光保温5-20分钟。

23、优选的，采样管为管口带螺纹的管体和管盖分离式，可以拧开或拧上管盖，管体的规格为：45.5×8mm(长×口径)，管盖的规格为：9×11.5mm(长×口径)。

24、优选的，本过氧化氢快速检测试剂盒的比色板采用通用的胶体金卡壳，材质为聚丙烯塑料(pp)，外观规格为70×20mm，卡槽规格为60×4mm，判读窗口规格为16×3.5mm。

技术实现思路