一种草果仁及其制剂的特征图谱的构建方法及其与伪品的鉴别方法与流程

本发明属于中药检测，具体涉及一种草果仁及其制剂的特征图谱的构建方法及其与伪品的鉴别方法。

背景技术：

1、草果是姜科植物草果amomum tsao-ko crevost et lemaire的干燥成熟果实，其种子为草果仁，中医中常以草果仁入药。秋季果实成熟时采收，除去杂质，晒干或低温干燥。呈长椭圆形，具三钝棱，长2～4cm，直径1～2.5cm。表面灰棕色至红棕色，具纵沟及棱线，顶端有圆形突起的柱基，基部有果梗或果梗痕。果皮质坚韧，易纵向撕裂。剥去外皮，中间有黄棕色隔膜，将种子团分成3瓣，每瓣有种子多为8～11粒。种子呈圆锥状多面体，直径约5mm；表面红棕色，外被灰白色膜质的假种皮，种脊为一条纵沟，尖端有凹状的种脐；质硬，胚乳灰白色。有特异香气，味辛、微苦，功能主治：燥湿温中，截疟除痰。用于寒湿内阻，脘腹胀痛，痞满呕吐，疟疾寒热，瘟疫发热。

2、草果仁为植物药，其所含成分多为挥发油类，萜类，酚类，黄酮类等。《中国药典》2020年版“草果仁”项下仅收载了性状、显微鉴别、薄层鉴别及挥发油的含量测定。

3、现有技术中关于草果仁的质量标准研究或者与常见伪品的鉴别研究，多集中于性状、鉴别、含量测定及指纹图谱的研究上。以前在研究该类成分时较常用gc-ms色谱法进行指纹图谱鉴别测定。另有研究采用hplc，以原儿茶醛、对羟基苯甲酸等为参照物，对不同产地15个批次草果仁药材进行hplc指纹图谱研究，确定21个共有特征峰，并确定草果仁药材的hplc指纹图谱共有模式图，然而，各特征峰分离度较差，特征性不明显。尤其是对于草果仁制剂来说，由于中药配方颗粒等由草果仁水提取物制得的制剂经过提取、研磨、浓缩、干燥等工艺有效成分与药材本身已有明显区别，采用该方法构建的特征图谱中特征峰更少，分离效果更差，此外采用高效液相色谱法对草果仁及其制剂与常见伪品进行鉴别目前还是一个空白，如何提高草果仁及其制剂的检测标准，全面地控制成品质量是本发明需要解决的技术问题。

技术实现思路

1、因此，本发明的第一个目的在于提供一种草果仁及其制剂的特征图谱的构建方法，该方法根据草果仁及其制剂的特点，加强专属性鉴别和多成分、整体性进行质量控制，建立了该品种的特征图谱，特征峰个数多且分离度高，特征性明显，可对草果仁及其制剂进行全面质量控制。

2、具体的，本发明公开了一种草果仁及其制剂的特征图谱的构建方法，包括以下步骤，

3、(1)供试品溶液的制备；

4、(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，波长为238-242nm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相包括含磷酸的水溶液和乙腈，梯度洗脱程序包括：0→20min→30min→50min，流动相中乙腈的体积百分数为：4％→19％→34％→45％。

5、本发明中，草果仁及其制剂可以是草果仁药材，草果仁饮片，也可以是由草果仁水提取物制成的制剂，例如粉剂、颗粒剂、片剂等。

6、在某些优选的实施方式中，步骤(2)中，流速为0.25-0.32ml/min，柱温为28-32℃，进样量为1-10μl。

7、进一步地，所述含磷酸的水溶液中磷酸的体积百分数为0.08-0.12％。

8、进一步地，所述梯度洗脱程序还包括50min→51min→56min→56.01min→62min，流动相中乙腈的体积百分数为：45％→95％→95％→4％→4％。

9、在某些优选的实施方式中，步骤(1)包括，称取草果仁供试品，加溶剂提取，得到提取液，固液分离，取液体，即为供试品溶液；

10、在某些优选的实施方式中，所述步骤(1)还满足如下a-e中的任意一项或者多项：

11、a、草果仁供试品的质量与溶剂的体积之比为0.1-0.4：15-50；所述质量与体积的配比关系为g/ml；

12、b、提取方式为回流提取或者超声提取；

13、c、提取时间为≥30min，优选为30-60min；

14、d、所述固液分离选自离心或者过滤；

15、e、溶剂选自甲醇、水和乙醇中的至少一种；优选为体积百分数为30-70％的甲醇水溶液。

16、在某些优选的实施方式中，所述的构建方法还包括采用原儿茶酸、原花青素b2、柠檬醛(包括橙花醛、香叶醛)中的至少一种加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照本发明任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品图谱的步骤；和/或，采用草果仁对照药材为参照物按照本发明任一所述的构建方法中的步骤(1)制备对照品参照物溶液，按照本发明任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品参照物溶液得到对照品参照物图谱的步骤。

17、优选的，每1ml对照品溶液中含各对照品5-50μg；和/或，对照品溶液制备中所采用的溶剂选自甲醇或者体积分数不小于50％的甲醇水溶液。

18、某些优选的实施方式中，还包括草果仁及其制剂的对照特征图谱的构建，对多批草果仁及其制剂供试品检测得到的特征图谱，利用中药色谱特征图谱相似度评价系统生成草果仁及其制剂的对照特征图谱。至少采用2批草果仁配方颗粒，例如采用4个批次、7个批次、15个批次、17个批次的草果仁配方颗粒。

19、某些优选的实施方式中，利用中药色谱特征图谱相似度评价软件生成草果仁及其制剂的对照特征图谱后还包括标记共有特征峰的步骤。

20、本发明的第二目的在于提供一种草果仁及其制剂与伪品的鉴别方法，该方法能够对草果仁和常见多种伪品及其制剂进行鉴别与区分，例如阳春砂仁、长序砂仁、牛牯砂仁、香砂仁、野草果、拟草果等，以更好的监控草果仁制剂的质量。

21、为此，本发明还提供了一种草果仁及其制剂与伪品的鉴别方法，包括将待鉴别产品的特征图谱与草果仁及其制剂的对照特征图谱进行比较的步骤；所述待鉴别产品的特征图谱为使用待鉴别产品按照上述任一所述的构建方法构建得到，所述草果仁及其制剂对照特征图谱选自如下(1)-(4)中的任意一项：

22、(1)其具有15个共有特征峰，与原花青素b2对照品参照峰相对应的峰为s1峰，峰1～峰3和峰5～峰10与s1峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；峰1～峰3和峰5～峰10的规定值依次为：0.38、0.60、0.80、1.11、1.27、1.31、1.40、1.72和1.88；以峰15为s2峰，峰11～峰14与s2峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内，峰11～峰14的规定值依次为：0.77、0.87、0.94、0.95；

23、(2)其具有15个共有特征峰，其中4个峰分别与原儿茶酸、原花青素b2、橙花醛、香叶醛对照品参照物峰保留时间相对应，与原花青素b2对照品参照峰相对应的峰为s1峰，峰2～峰3和峰5～峰10与s1峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；以峰15为s2峰，峰11～峰13与s2峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；规定值为：0.60(峰2)、0.80(峰3)、1.11(峰5)、1.27(峰6)、1.31(峰7)、1.40(峰8)、1.72(峰9)、1.88(峰10)、0.77(峰11)、0.87(峰12)、0.94(峰13)；

24、(3)使用单批次或者多批次草果仁和/或其制剂为供试品按照上述任一所述的构建方法得到的草果仁和/或其制剂的特征图谱；

25、(4)使用多批次草果仁和/或其制剂为供试品按照上述任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。

26、进一步地，所述草果仁及其制剂对照特征图谱中，峰7与峰1的相对峰面积在规定值的范围内，规定值为：不得低于5.9(峰7)。

27、进一步地，所述伪品包括砂仁及其制剂、草豆蔻仁及其制剂、野草果及其制剂、拟草果及其制剂中的一种或者多种；优选的，所述砂仁包含阳春砂仁、长序砂仁、牛牯砂仁、香砂仁中的一种或者多种。

28、若待鉴别产品的特征图谱中呈现草果仁配方颗粒对照特征图谱中相对应15个特征峰，和/或，峰7与峰1的相对峰面积高于5.9，则为草果仁或其制剂，反之则不是。

29、本发明还提供了一种草果仁及其制剂的质量检测方法，包括将待测草果仁产品的特征图谱与草果仁及其制剂的对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测草果仁产品的特征图谱为使用待测草果仁产品按照上述任一所述的构建方法得到，所述草果仁及其制剂对照特征图谱选自如下(1)-(4)中的任意一项：

30、(1)其具有15个共有特征峰，与原花青素b2对照品参照峰相对应的峰为s1峰，峰1～峰3和峰5～峰10与s1峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；峰1～峰3和峰5～峰10的规定值依次为：0.38、0.60、0.80、1.11、1.27、1.31、1.40、1.72和1.88；以峰15为s2峰，峰11～峰14与s2峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内，峰11～峰14的规定值依次为：0.77、0.87、0.94、0.95；

31、(2)其具有15个共有特征峰，其中4个峰分别与原儿茶酸、原花青素b2、橙花醛、香叶醛对照品参照物峰保留时间相对应，与原花青素b2对照品参照峰相对应的峰为s1峰，峰2～峰3和峰5～峰10与s1峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；以峰15为s2峰，峰11～峰13与s2峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；规定值为：0.60(峰2)、0.80(峰3)、1.11(峰5)、1.27(峰6)、1.31(峰7)、1.40(峰8)、1.72(峰9)、1.88(峰10)、0.77(峰11)、0.87(峰12)、0.94(峰13)；

32、(3)使用单批次或者多批次草果仁和/或其制剂为供试品按照上述任一所述的构建方法得到的草果仁和/或其制剂的特征图谱；

33、(4)使用多批次草果仁和/或其制剂为供试品按照上述任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。

34、其中，本发明中待测草果仁产品可以是草果仁药材，草果仁饮片，也可以是由草果仁水提取物制成的制剂，例如粉剂、颗粒剂、片剂等。

35、采用相对峰面积评价待测草果仁配方颗粒产品的质量，当待测草果仁配方颗粒产品的特征图谱峰1与峰7相对峰面积如果不低于5.9，则为质量合格；如果低于5.9，则为不合格。

36、本发明技术方案，具有如下优点：

37、1.本发明所述的草果仁及其制剂的特征图谱的构建方法，波长为238-242nm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相包括含磷酸的水溶液和乙腈，通过特定的梯度洗脱程序，得到15个共有特征峰，并实现了包括原儿茶酸、原花青素b2、橙花醛、香叶醛在内的共有特征峰的分离，洗脱程序简单，得到的特征图谱基线平稳，特征峰峰形好、分离度高，而且可以准确定位原儿茶酸、原花青素b2、柠檬醛(橙花醛、香叶醛)的峰位置，充分的反映草果仁及其制剂的整体性和特征性，为草果仁及其制剂的质量检测和控制提供依据。

38、2.本发明所述的草果仁及其制剂的特征图谱的构建方法，通过优化色谱条件、检测波长、提取溶剂、提取时间等提取条件进行考察，确定了最佳提取工艺，使得峰面积更高，能够更加全面的对草果仁及其制剂进行质量监控。

39、3.本发明所述的草果仁及其制剂与伪品的鉴别方法，通过采用本发明的上述方法构建特征图谱后与草果仁及其制剂的对照特征图谱进行比较，即可实现草果仁及其制剂与包括阳春砂仁、长序砂仁、牛牯砂仁、香砂仁等常见砂仁伪品及其制剂、野草果及其制剂、拟草果及其制剂、草豆蔻仁及其制剂的鉴别。

40、4.本发明所述的草果仁及其制剂的质量检测方法，通过待测草果仁及其制剂产品的特征图谱与草果仁及其制剂的对照特征图谱进行比较，可以全面、清楚、有效的对草果仁及其制剂进行质量检测。