一种基于TLC-SERS技术的快速，自动化区分混合物溶液中成分的方法

本发明属于色谱检测领域，具体涉及一种sers技术、薄层色谱技术结合机器学习算法应用于快速自动化区分混合物中成分的方法。

背景技术：

1、表面增强拉曼散射薄层色谱法(tlc-sers)作为一种新的分析化学工具显示出巨大的潜力，并因其高灵敏度和易于实施而获得越来越多的研究兴趣。tlc技术将多种功能协同集成在乳胶板上，通过结合不同的洗脱液(流动相)和吸附层(固定相)实现混合物的分离。sers技术基于纳米结构之间的等离子共振效应放大分子振动光谱，从而实现痕量级化学检测。只要流动相和固定相搭配得当，tlc-sers就能非常成功地从复杂的化学和生物样品中检测出单一目标物质。因此，tlc-sers已广泛应用于食品安全、农业、医疗诊断和工业检测等领域。

2、传统的sers检测通常在湿态溶液或干膜形成状态下进行。动态sers方法是在纳米溶液从湿态过渡到干态的过程中进行的，以找到确保最大增强效果的最佳基底状态。目前，tlc-sers面临着几个关键挑战：(1)tlc-sers技术通常是将金纳米颗粒和银纳米颗粒(nps)投放到含有样品的tlc板上进行动态sers检测。金溶胶和银溶胶的浓度和体积以及检测时间等因素都会对sers检测结果产生重大影响。此外，这还会对连续sers测量产生不良干扰。(2)tlc技术分离的不完善，导致tlc-sers技术在检测多种目标物质时面临更大的挑战。在识别多种物质时，不同物质的sers信号强度波动较大，会导致信噪比较低。人工分析sers光谱只能分析目标物质的一个或几个特征峰，很难完成对混合物的准确分析。特别是面对结构相似的物质，既难以通过tlc分离，又具有相同类型的化学键。(3)传统tlc-sers技术作为一种人工分析技术，它过分依赖于操作人员的主观解释和能力。随着光谱数量的增加，这种方法将难以为继。

技术实现思路

1、本发明针对上述存在tlc-sers无法准确分析结构相似的物质，以及过于依赖于操作人员的主观解释和能力的问题，而提供一种基于tlc-sers技术的快速，自动化区分混合物溶液中成分的方法。

2、本发明的一种基于tlc-sers技术的快速，自动化区分混合物溶液中成分的方法，它是按照以下步骤进行的：

3、步骤1：使用溶胶法制备银溶胶纳米粒子ag nps；

4、步骤2：使用三相界面自组装的方法制备tlc-sers基底

5、将制备的银溶胶纳米粒子ag nps、二氯甲烷、去离子水按照体积比(0.01-0.1)：(0.1-1)：1的比例混合得到溶液b；再将溶液b与正己烷按照体积比为(2-100)：1的比例混合，并静置1-30min；采用提拉法，将银溶胶纳米粒子ag nps转移到tlc板上，得到tlc-sers基底；

6、步骤3：采用tlc-sers基底对混合物进行分离并进行光谱采集

7、在制备的tlc-sers基底底端滴加待分析的混合物，干燥3-10min后，放入展开剂中，展开10-40min后，干燥10-30min，随后采用拉曼光谱仪沿着tlc-sers基底上混合物展开的路径进行一维的扫描采集sers光谱，扫描步长为50-200nm，扫描时间为5-30秒，激光功率为10-100mw；

8、步骤4：采用机器学习算法对tlc-sers基底上采集的光谱进行自动化分析

9、基于python程序中卷积神经网络算法和光谱角算法分别编写光谱分类模型和光谱相似度模型，将上述采集的sers光谱输入到光谱分类模型和光谱相似度模型中进行自动化分析：光谱分类模型用于预测sers光谱对应的物质种类信息，光谱分类模型采用卷积神经网络，卷积神经网络的输入为sers光谱二维数据，输出为sers光谱对应的物质种类信息对应的分类曲线；

10、光谱相似度模型用于计算标准光谱与采集的sers光谱的相似度；利用标准光谱与采集的sers光谱的光谱角计算相似度，得到相似度曲线；

11、同时根据分类模型曲线与相似度模型曲线在tlc-sers基底上的位置准确的识别待分析混合物中不同成分所在的范围。

12、所述的识别待分析混合物中不同成分所在的范围是指识别待分析混合物在tlc板上的位置。本发明是沿着tlc板一条直线连续扫描采集光谱，即每隔固定距离采集一个光谱。

13、例如，在tlc板每隔200um采集一次，共采集十个光谱，分别是abc三个物质的光谱。比如从第五个光谱开始，有连续3个位置是物质b，由于本发明是沿着tlc板一条直线连续扫描采集光谱，即每隔200um采集一个光谱，那么就意味着物质b在光谱板上从5*200＝1000um处开始，1400um处结束范围内。本发明采用连续采集光谱的方式让光谱带有了空间位置属性。随机位置采集光谱的话就没有这种属性。连续采集，控制间隔距离，那么第100个光谱即采集的地点是间隔距离×100的位置。因此，识别出物质b从开始到结束的光谱序数，就可以确定其在tlc板上的位置。

14、所述的标准光谱是用来训练分类模型的。

15、进一步地，步骤一中所述的银溶胶纳米粒子制备如下：

16、在室温状态下，将抗坏血酸和柠檬酸钠分散在超纯水中搅拌溶解得到溶液a；然后将溶液a转移到水浴锅中，随后将硝酸银溶液加入到溶液a中煮沸反应，持续反应1-3小时后得到银溶胶纳米粒子；最后，待反应完成冷却到室温后收集ag nps，用水溶液离心洗涤两次，取收集到的离心产物分散在水中，即完成银溶胶纳米粒子制备。

17、进一步地，抗坏血酸、柠檬酸钠与超纯水的质量体积比为(1～100)mg：(100～500)mg：1ml。

18、进一步地，硝酸银溶液与超纯水的质量体积比为1：1～20。

19、进一步地，离心转速为5000-10000rpm，离心时间为10-40min。

20、进一步地，待分析的混合物的加入量为1-10ul。

21、进一步地，步骤4中自动化分析是通过分类模型自动化确定实验光谱中的种类信息，相似度模型比较实验光谱与标准光谱的相似度。

22、进一步地，所述的将上述采集的sers光谱输入到光谱分类模型自动化分析如下：

23、采用卷积神经网络分类算法中对sers光谱进行预测，预测结果为sers光谱对应的物质种类信息。

24、进一步地，所述的标准光谱是指纯物质的拉曼散射光谱。采用拉曼光谱仪对纯物质进行光谱采集得到的。所述的纯物质待分析物对应的纯物质。

25、图8显示了本发明采用机器学习算法对tlc-sers基底上采集的光谱进行自动化分析流程图。cnn由多个功能层组成，包括卷积层、池化层和全连接层。池化层在保留光谱特征的同时降低了数据维度，位于卷积层之后。结合卷积层和池化层的功能单元从输入数据中探索并提取最关键的特征，从而优化模型的性能。最后，全连接层将提取的关键特征表示映射到样本的标签空间。在这项工作中，cnn算法的特征提取部分包含两个池化层和三个卷积层。cnn采用自适应矩估计优化算法，对带有类别标签的原始拉曼光谱数据进行训练。训练过程由cuda加速，relu函数实现了特征图的非线性变换作为激活函数，核大小为1*3，步长为2。学习率为0.01。拉曼光谱数据总量的75％用于模型训练，其余数据用于测试。训练和测试数据的选择是随机的，这进一步提高了模型的泛化能力。本发明还使用迭代算法来确保cnn模型的泛化能力。每次迭代后，针对训练数据的cnn模型选择都是完全随机的，这可以有效防止模型的过拟合。

26、本发明所采用的卷积神经网络为：第一卷积层+第一池化层+第二卷积层+第二池化层+第三卷积层+第一全连接层+第二全连接层+第三全连接层；

27、第一卷积层：卷积核大小为1*3，卷积核的个数为10，步长为2；经过relu激活后，得到650*10的特征矩阵；

28、第一池化层：池化方式选为最大池化，池化核尺寸为1*3，步长为2，卷积层1输出的特征矩阵经过池化操作后输出矩阵大小为325*10；

29、第二卷积层：卷积核大小为1*3，卷积核的个数为20，步长为2；经过relu激活后，得到163*20的特征矩阵；

30、第二池化层：池化方式选为最大池化，池化核尺寸为1*3，步长为2，输出矩阵大小为82*20；

31、第三卷积层：卷积核大小为1*3，卷积核个数为40，步长为1；经过relu激活后，得到82*40的特征矩阵；

32、第一全连接层：将提取后拍平的3280个特征全连接为1000个特征；

33、第二全连接层：将1000个特征连接为300个特征；

34、第三全连接层：将300个特征连接为所需要的类别数，浓度识别模型中最终全连接后的个数为1个，即为识别种类；

35、进一步地，所述的将标准光谱与采集的sers光谱输入到光谱相似度算法进行二次判别，通过计算标准光谱与采集的sers光谱之间的光谱角，再进行余弦运算，得到0到1之间的数值，如果输出的数值接近1，光谱相似度高，即卷积神经网络分类模型结果正确，以此确定标准光谱与采集的sers光谱之间的相似程度，完成所述的二次判别。

36、进一步地，所述的光谱角的计算基于以下公式：

37、

38、其中，θ为光谱角，arccos为反余弦，xi为标准光谱第i拉曼位移处的值，yi为测试光谱第i拉曼位移处的值。

39、本发明开发了一种客观、准确、高效的tlc-sers传感途径，能够快速自动化的检测复杂混合物中的多种物质。首先，通过界面自组装方法在tlc板表面组装银溶胶纳米粒子(ag nps)，制备出具有高灵敏度和可重复检测的大面积tlc-sers基底。沿着tlc路径进行一维光谱采集，生成所有目标物质的tlc-sers光谱。然后，采用两种机器学习算法(卷积神经网络分类模型和光谱角度相似性模型)对tlc-sers光谱数据进行分析。与传统的人工sers峰分析方法相比，所提出的机器学习算法依赖于对tlc-sers光谱数据的空间信息和光谱信息的整体分析，而不是依赖于主要特征sers峰所确定的光谱信息，这大大提高了不同物质sers峰识别的准确性。此外，本发明只需采集一次纯物质的sers光谱作为标准光谱，就可以应用于各种混合物的自动识别，这大大提高了所提方法的可扩展性。最重要的是，卷积神经网络(cnn)模型与光谱角(sa)模型协同工作，即使目标物质在tlc路径上重叠，也能达到很高的准确度。因此，这种自动化、客观的tlc-sers光谱检测和分析方法在快速混合物检测方面具有很大的应用潜力。