基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析甘草多糖的方法与流程

本发明涉及检测，尤其涉及一种基于uplc-q-tof-ms/ms技术分析甘草多糖的方法。

背景技术：

1、基于uplc-q-tof-ms/ms技术分析甘草多糖的方法，目前已经有一些现有的技术和方法。以下是其中几种常用的方法：离子对色谱法，该方法通过添加离子对试剂，如三氟乙酸、甲酸等，以增强多糖化合物在uplc柱上的保留和分离效果。离子对试剂与多糖之间形成离子对复合物，提高了多糖的检测灵敏度和分离度。聚合物逆向相色谱法，该方法使用聚合物修饰的反相色谱柱，如聚合物甲基丙烯酸酯柱、聚合物乙烯基苯柱等，增强了多糖的保留和分离效果，并提高了质谱的信号强度。阴离子交换色谱法，该方法使用具有阴离子交换功能的色谱柱，如强阴离子交换柱，通过控制流动相中的ph值和离子强度，实现多糖的分离和定量分析。聚合物凝胶色谱法，该方法使用聚合物凝胶柱，如聚丙烯酰胺凝胶，通过多糖在凝胶柱中的分子大小和形状的差异，实现多糖的分离和纯化。质谱联用技术，将uplc与高分辨质谱仪联用，实现多糖的分子式、分子量和结构鉴定。通过质谱的高灵敏度和高分辨率，可以准确分析复杂的多糖混合物。

2、这些方法需要根据实际需要进行选择和优化，以获得高效、灵敏和准确的甘草多糖分析结果。

3、中国发明授权专利cn109553654b公开了一种从甘草中提取甘草甜素、甘草黄酮及甘草多糖的方法，所述从甘草中提取甘草甜素的方法，包括以下步骤：（1）将干燥的甘草根或根茎粉碎，投入渗漉器中，压紧，加水，在室温下，渗漉提取，得渗漉液；（2）超滤，收集超滤膜透过液；（3）上阴离子交换树脂柱，用洗脱剂洗脱，洗脱液减压浓缩，调节ph值至酸性，在室温下，搅拌析晶，离心过滤，冰水洗晶，干燥，得甘草甜素。该发明方法还公开了提取甘草黄酮及甘草多糖的方法。该发明方法所得甘草甜素、甘草黄酮和甘草多糖的纯度和收率高；该发明方法可提取多种活性成分，工艺过程可操作性强，成本低，不使用有毒有害化工溶剂、绿色环保，甘草资源高效综合利用，适宜于工业化生产。但是该发明提取方法分离性能差，不能完全提取甘草中的各种成分。

技术实现思路

1、有鉴于现有技术中甘草多糖的提取方法分离性能差的缺点，本发明所要解决的技术问题是提供一种分离性能好的基于uplc-q-tof-ms/ms技术分析甘草多糖的方法。

2、为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

3、一种基于uplc-q-tof-ms/ms技术分析甘草多糖的方法：

4、步骤1、供试品溶液配制：称取甘草多糖，加入超纯水，超声处理溶解后，摇匀，制得甘草多糖溶液，经微孔滤膜过滤，得到供试品溶液；

5、步骤2、色谱条件：采用waters acquity uplc beh c18色谱柱（2.1mm×100 mm，1.7μm）；采用流动相梯度洗脱，固定相为改性固定相；

6、步骤3、质谱条件：采用电喷雾离子源（esi），正、负离子2种模式扫描，质谱扫描；正离子模式下，负离子模式下，毛细管电压-4000~-5000kv，裂解电压-70~-90v，碰撞能量30~40ev；

7、步骤4、数据分析、采用analyst tf 1.8.1数据采集软件（美国 ab sciexi 公司），采集时间20~40min；采用sciex os 2.0.0软件进行数据处理（美国ab sciexi 公司），化学成分依据相对分子质量、离子碎片信息、保留时间，结合数据库及文献报道数据结果进行分析。

8、优选的，所述步骤1中为称取0.5~2重量份甘草多糖，加入超纯水，超声溶解后，摇匀，制得浓度为4~6mg/ml的甘草多糖溶液。

9、优选的，所述步骤1中微孔滤膜的孔径为0.2~0.25μm。

10、优选的，所述步骤2中流动相为乙腈和0.05~0.2wt%甲酸水溶液配置而成。

11、优选的，所述步骤2中流动相梯度洗脱参数为：0~2min，流动相由5%乙腈、0.05~0.2wt%甲酸水溶液补足100%组成；2~42min，流动相由5%~95%乙腈、0.05~0.2wt%甲酸水溶液补足100%组成；42~47min，流动相由95%乙腈、0.05~0.2wt%甲酸水溶液补足100%组成；47~47.1min，流动相由5%~95%乙腈、0.05~0.2wt%甲酸水溶液补足100%组成；47.1~50min，流动相由5%乙腈、0.05~0.2wt%甲酸水溶液补足100%组成；流速0.2~0.4ml/min；柱温：35~45℃；进样量4~6μl。

12、优选的，所述步骤3中质谱扫描范围m/z 100~1500da，雾化气压50~60psi，辅助气压50~60psi，气帘气压30~40psi。

13、优选的，所述步骤3中正离子模式下参数为：毛细管电压5000~6000v，裂解电压80~120v，碰撞能量30~40ev。

14、优选的，所述步骤3中负离子模式下参数为：毛细管电压-4000~-5000kv，裂解电压-70~-90v，碰撞能量30~40ev。

15、所述改性固定相的制备方法如下，以重量份计：

16、s1、将4~6份二氧化硅粉末、8~12份3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷、8~12份水和0.5~2份乙酸加入到18~22份无水乙醇中，在50~70℃油浴中搅拌20~40min，静置3~5h，得到预处理物；

17、s2、将0.1~0.3份甲基丙烯酰胺、0.04~0.06份海藻酸钠和0.04~0.06份n,n'-亚甲基-双丙烯酰胺加入到30~50份水中，进行超声处理，然后加入2~4份步骤s1制备的预处理物，100~500rpm磁力搅拌0.5~2h，静置8~15h，再加入0.04~0.06份过硫酸铵、0.004~0.006份硫酸钙和0.1~0.2份金属有机骨架材料，在50~70℃油浴中进行交联聚合1~3h，用氮气鼓泡除去混合物中溶解的空气，然后加热至50~70℃，100~300rpm搅拌回流冷凝4~6h，随后，温度加热到70~90℃，在100~200rpm搅拌下完全蒸发溶剂，然后，加入40~60份水浸泡一夜，最后用水洗涤1~3次，在70~90℃真空烘箱中干燥5~15h，得到后处理物；

18、s3、将2~3份后处理物在20~30份四氯甲烷中超声处理，以正己烷为推进液，在30~50mpa的压力下将混合物填充到140~160×4~5mm不锈钢管中，当流出的液体体积超过100ml时，床层稳定，充填完成，得到改性固定相。

19、优选的，所述超声处理时间各自独立地为10~30min、超声功率各自独立地为200~500w、超声频率各自独立地为20~60khz。

20、本发明采用uplc-q-tof-ms/ms技术对甘草多糖化学成分进行定性分析，以明确甘草多糖中化学成分。

21、采用waters acquity uplc beh-c18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；乙腈-甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流速0.3 ml/min，柱温40℃，进样量5μl，固定相为改性固定相。采用电喷雾离子源，在正、负离子模式下对甘草多糖进行质谱扫描。通过analyst tf1.8.1软件和sciex os 2.0.0软件进行数据采集和数据处理。根据高分辨质谱提供的化合物相对分子质量、离子碎片信息，参考文献报道的质谱数据并对比数据库分析结果，对甘草多糖中化学成分进行分析。

22、在正、负离子模式下共分析出95种化学成分，其中包括57种黄酮类成分，18种三萜类成分，4种香豆素类成分，3种有机酸类成分，其他类包括7种氨基酸类成分、3种糖类成分、3种核苷类成分，共13种。uplc-q-tof-ms/ms技术能有效分析出甘草多糖中化学成分，可为甘草多糖后续实验提供支撑。

23、与现有技术相比，本发明的有益效果：

24、1）本发明通过使用uplc-q-tof-ms/ms技术能有效分析出甘草多糖中化学成分，可为甘草多糖后续实验提供支撑。

25、2）本发明采用的改性固定相中存在多模式相互作用，具有更好的分离性能和良好的稳定重复性，在实际应用中具有重要作用，拓展了在色谱分离领域的潜在应用。