一种菌丝体蛋白含量的快速检测方法与流程

本发明属于近红外光谱无损检测领域，特别是涉及一种菌丝体蛋白含量的快速检测方法。

背景技术：

1、真菌蛋白作为可持续蛋白来源，具备替代部分传统肉类和植物蛋白的潜力。对于缓解传统畜牧业对资源的需求、减少温室气体排放以及提高食品模型的安全性具有重要意义。利用真菌蛋白可以开发出各种新颖的食品和食品成分，如富含优质蛋白的产品、蛋白饮料等，有助于食品产业的创新和多样性。因此，合理利用真菌蛋白，能够有效缓解我国正面临的蛋白短缺的问题。其中，丝状真菌由于其高效的蛋白转化效率、蛋白含量高和纤维化结构等特征，在食品中具有巨大的应用潜力。

2、目前，检测丝状真菌菌丝体蛋白含量的方法有很多，如凯氏定氮法、燃烧法、分光光度法等，这些方法虽然检测结果可靠，但是存在耗费时间长，使用化学试剂污染环境等问题，无法满足快速、无损检测菌丝体中蛋白含量的需求。近红外光谱技术因其不损伤样品、高效和成本低等优点，在传统食品成分检测领域应用广泛。

技术实现思路

1、本发明针对传统方法检测菌丝体蛋白含量耗费时间长、损坏样品及使用化学试剂污染环境等问题，建立一种基于近红外光谱技术的快速、无损检测菌丝体蛋白含量的方法。

2、本发明提供了一种菌丝体蛋白含量的快速检测模型的建立方法，其包括以下步骤：

3、s1配制液体培养基，接种丝状真菌，发酵后抽滤收集菌丝体，同时用无菌水清洗；按照国标方法测定菌丝体湿物质样品的含水率和烘干后菌丝体干物质的蛋白含量并换算出菌丝体湿物质的蛋白含量；

4、s2用近红外光谱仪扫描样品，获得样品的原始光谱数据；随后将样品近红外光谱数据和s1步中测定的含水率、蛋白含量对应，建立数据库；

5、s3对原始光谱数据进行预处理，降维和特征提取；

6、s4将样品随机划分为训练集和验证集：基于训练集样品的近红外光谱数据和含水率数据，建立检测菌丝体中含水率的模型a，再根据验证集样品的光谱数据和含水率数据验证模型的精度和稳定性；

7、s5基于训练集样品的近红外光谱数据和蛋白含量数据，建立检测菌丝体湿物质中蛋白含量的模型b，再根据验证集样品的光谱数据和蛋白含量数据验证模型的精度和稳定性；

8、s6基于s4、s5步模型预测的湿物质含水率、湿物质蛋白含量及干物质蛋白含量检测值，建立检测菌丝体干物质中蛋白含量的模型c，经验证精度和稳定性后即可用于菌丝体干物质中蛋白含量的快速检测。

9、s2步中，所述的近红外光谱仪的光谱扫描范围是10000~6250cm-1，每个样品三个不同位置各采集一次光谱数据，取平均值作为样品的原始光谱数据。

10、s3步中，采用多元散射校正、标准正态变换、趋势校正、一阶导数、二阶导数、小波变换、sg平滑、矢量归一化中的一种或多种方法对采集的原始光谱数据进行预处理，随后使用主成分分析和随机森林算法进行数据降维，选取特征。

11、s3步中，具体地，将样品在不同波段下的光谱数据采用标准正太变换和小波变换进行预处理，利用主成分分析计算对应波段数量个数的主成分的贡献率，当累计贡献率达到0.9999时，得到对应数量个数的主成分；

12、利用随机森林算法计算主成分对预测含水率的重要性并按照降序排序，当累计重要性达到0.95时，将排在前面的主成分作为特征，以提取与含水率相关的特征；

13、利用随机森林算法计算主成分对预测蛋白含量的重要性并按照降序排序，当累计重要性达到0.95时，将排在前面的主成分作为特征，以提取与蛋白含量相关的特征。

14、s4步中，利用spxy算法随机将样品划分为训练集和验证集。优选地，s4步中，采用偏最小二乘法拟合训练集样品的光谱数据和含水率数据，构建检测菌丝体湿物质中含水率模型；采用偏最小二乘法拟合训练集样品的光谱数据和蛋白含量数据，构建检测菌丝体湿物质中蛋白含量的模型。

15、更优选地，s4步中，利用偏最小二乘法将训练集样品的含水率作为因变量，经过主成分分析和随机森林算法提取特征的光谱数据作为自变量，进行拟合，建立检测菌丝体湿物质中含水率的模型a，再用验证集样品的光谱数据和含水率数据验证模型的精度和稳定性，若决定系数r2>0.9，均方根误差rmse<0.1，模型满足要求；

16、利用偏最小二乘法将训练集样品的蛋白含量作为因变量，经过主成分分析和随机森林算法提取特征的光谱数据作为自变量，进行拟合，建立检测菌丝体湿物质中蛋白含量的模型b，再用验证集样品的光谱数据和蛋白含量数据验证模型的精度和稳定性，若决定系数r2>0.9，均方根误差rmse<0.1，模型满足要求；

17、s6步中的模型c的构建方法为：将菌丝体湿物质中含水率模型a的预测结果和菌丝体湿物质中蛋白含量模型b的预测结果作为自变量，烘干后菌丝体干物质中蛋白含量作为因变量，用随机森林算法进行拟合，建立预测菌丝体干物质中蛋白含量的模型c。

18、基于检测菌丝体湿物质中含水率的模型a的检测结果和检测菌丝体湿物质中蛋白含量的模型b的检测结果，选取菌丝体湿物质含水率在0.4~0.65、蛋白含量在0.15~0.29的样品以及对应烘干后菌丝体干物质中蛋白含量，建立预测菌丝体干物质中蛋白含量的模型c。若模型c决定系数r2>0.85，可用于检测菌丝体干物质中蛋白含量。

19、具体地，所述丝状真菌是毛霉、根霉、根毛霉、木霉或曲霉。

20、本发明也提供所述的建立方法得到菌丝体湿物质中含水率检测的模型a、菌丝体湿物质中蛋白含量检测的模型b或菌丝体干物质中蛋白含量检测的模型c。

21、本发明提供一种菌丝体蛋白含量的快速检测方法，其利用所述的模型进行检测，获得检测结果，即菌丝体干物质中蛋白含量。

22、具体地，其步骤如下：

23、第一步，准备菌丝体：取用滤膜抽滤发酵后的丝状真菌发酵液以收集菌丝体，将菌丝体压实，厚度均匀；

24、第二步，获得原始光谱数据；

25、第三步，将原始光谱数据输入所述的检测菌丝体湿物质中含水率的模型a中，输出结果即得到菌丝体湿物质中含水率预测值；将原始光谱数据输入所述的检测菌丝体湿物质中蛋白含量的模型b中，输出结果即得到菌丝体中湿物质中蛋白含量的预测值；

26、第四步，将菌丝体湿物质中含水率和蛋白含量模型检测值输入模型c即可输出菌丝体干物质中蛋白含量。

27、优选地，第二步中，将近红外光谱仪设置模式宽度为8.2，平均扫描次数为5-10次，在26℃，相对湿度为45%的环境下，采集光谱数据，每个样品三个不同位置各采集一次光谱数据，取平均值作为样品的原始光谱数据。

28、基于s1步中根据同一丝状真菌在不同培养基发酵得到的菌丝体，最终在s6步中评估不同培养基下菌丝体中蛋白含量，用于筛选最佳的培养基；基于s1步中根据不同丝状真菌在相同培养基发酵得到的菌丝体，最终在s6步中评估相同培养基下不同菌株产蛋白能力，用于筛选高蛋白产量菌株。

29、本发明的技术效果为：

30、本发明基于近红外光谱技术建立快速、无损检测菌丝体蛋白含量的方法。测定了300个样品的水分和相应状态下的蛋白含量，用近红外光谱仪采集样品的近红外光谱数据，通过多元散射校正、标准正态变换、趋势校正、一阶导数、二阶导数、小波变换、sg平滑、矢量归一化中的一种或多种方法对采集的原始光谱数据进行预处理，随后使用主成分分析进行数据降维，随机森林算法提取特征波段，再结合偏最小二乘法拟合光谱数据与水分和蛋白含量，建立检测菌丝体湿物质中含水率和蛋白含量的方法，结合菌丝体干物质中蛋白含量数据，建立检测菌丝体中蛋白含量的方法。

31、本发明与菌丝体蛋白含量检测的传统方法相比，具有如下优点：操作简单，不需进行样品前处理、不需要专业的检测人员，只需将样品放在近红外光谱仪镜头上获取样品的光谱数据输入模型；节约时间，一个样品的检测时间只需5-20s，每天可以检测800个样品，是传统化学检测方法的30倍以上；在发酵过程中提供实时或近实时数据，以便及时采取措施纠正问题或优化丝状真菌发酵过程，从而降低风险和损失；无需昂贵的检测仪器，不使用化学试剂，检测成本低且不污染环境。