一种同时测定食品中米酵菌酸、异米酵菌酸和毒黄素的方法与流程

本发明涉及食品检测，具体涉及一种同时测定食品中米酵菌酸、异米酵菌酸和毒黄素的方法。

背景技术：

1、椰毒假单胞菌酵米面亚种(pseudomonas cocovenenanssubsp.farinofermentans，简称椰酵假单胞菌)是环境中常见的食源性致病菌，谷物及薯类制品、发酵米面制品、变质银耳、黑木耳等食品容易感染该致病菌。人误食被椰毒假单胞菌污染的食品出现食物中毒，症状轻的恶心呕吐、腹痛腹胀、头晕、全身无力，严重者可出现黄疸、腹水、皮下出血、惊厥、抽搐、血尿甚至是肝衰竭、肾衰竭，没有特效解毒药物，严重会导致死亡。椰毒假单胞菌会产生多种毒素，其中米酵菌酸是关注度最高的一种，其小鼠静注半致死量(ld50)为1.14mg/kg。椰毒假单胞菌产生米酵菌酸的同时还会产生异米酵菌酸，其与米酵菌酸互为同分异构体，毒性约为米酵菌酸毒性的25-50％。米酵菌酸在光照条件下会转化成异米酵菌酸。毒黄素也是由椰毒假单胞菌产生的毒素，其ld50为1.7mg/kg。这些毒素毒性极强，米酵菌酸抑制线粒体上腺嘌呤核苷酸转移酶的活性，导致细胞凋亡、损害；毒黄素进入细胞，从还原性辅酶接收氢再转交氧分子，产生大量过氧化氢而表现毒性。若出现椰毒假单胞菌中毒事件，由于米酵菌酸与毒黄素的致病机理不同，治疗方案也会大相径庭，如果只是关注米酵菌酸而忽视毒黄素的存在，可能会导致不可预知的错误。为了彻底弄清引起椰毒假单胞菌中毒的罪魁祸首，仅仅检测米酵菌酸(含异米酵菌酸)是不够的，对于毒黄素的检测确证也极为重要。

2、目前，针对米酵菌酸的检测方法有液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。国家标准方法gb 5009.189-2023中第一、二法分别采用的是高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法，方法检出限分别为5μg/kg、1μg/kg，而毒黄素及异米酵菌酸暂无国家标准检测方法。河南省疾控中心的张伟等人(超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱串联质谱法快速检测食物中毒样品中的毒黄素。中国卫生检验杂志，2021，31(15)：1811-1817；超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱技术快速检测酵米面中米酵菌酸和毒黄素的含量。中国卫生检验杂志，2022，32(3)：284-287。)采用bond elut plexa pcx固相萃取法和以c18、psa粉末、无水硫酸钠作为净化剂的quechers方法联合高效液相色谱-串联质谱法，进行了食物中毒样品和酵米面中毒黄素和米酵菌酸的检测。此外，液相色谱串联四极杆线性离子阱质谱(lc-ms/ms-qtrap)测定秸秆发酵饲料中米酵菌酸和毒黄素的方法也有报道(索德成，肖志明，张晶等，液相色谱串联四极杆线性离子阱质谱测定秸秆发酵饲料中米酵菌酸和毒黄素。中国饲料，2022，19：93-98。)，该方法米酵菌酸和毒黄素的检出限分别为0.7μg/kg和1.5μg/kg。专利方面，惠州市食品药品检验所公开了两篇米酵菌酸和毒黄素同时检测的专利(中国授权专利cn 112505223 b、申请公开专利cn 115616116 a)，但这两项专利只是改变了仪器测定方法，从高相液相色谱-紫外检测法更换成液相色谱-串联质谱法，对于样品的前处理没有显著改进和创新，两者均使用了商品化的dspe emr-lipid和dspe emr-lipid+nacl/mgso4做净化剂来实施quechers前处理方法。需要说明的是，专利与文献有矛盾之处，专利说明书中阐述了采用c18、psa粉末的quechers方法会吸附目标化合物从而降低米酵菌酸和毒黄素回收率而选用dspe emr-lipid吸附剂，而文献恰恰采用了c18、psa粉末作为净化剂。dspe emr-lipid吸附剂主要是用来去除脂质的，而银耳、黑木耳、玉米面以及湿米粉中脂质含量极少，碳水化合物是其主要成分，木耳银耳含有丰富的胶质和纤维素，玉米面湿米粉含有大量淀粉，仅采用去除脂质的吸附剂来净化样品其效果值得商榷。

3、米酵菌酸与毒黄素化学结构迥然不同，两者理化性质差别大。米酵菌酸是长链脂肪酸结构，具有弱酸性，易溶于石油醚、正己烷、乙醚、氯仿、甲醇等有机溶剂和碱性水溶液，对酸性条件、氧化剂和日光不稳定。毒黄素是含多个氮的碱性化合物，溶于水、甲醇、乙腈等，不溶于石油醚等非极性溶剂。如采用完全相同的提取和净化方法，可能很难兼顾两者的提取效率和回收率，使得样品测定不够准确。

技术实现思路

1、本发明针对椰毒假单胞菌产生的毒素的检测方法欠缺、方法灵敏度低、检测准确度不高等缺陷，提出了一种食品中米酵菌酸(bongkrekic acid)、异米酵菌酸(isobongkrekic acid)和毒黄素(toxoflavin)同时检测的方法。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种同时测定食品中米酵菌酸、异米酵菌酸和毒黄素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

4、(1)样品提取：称取样品，使用提取液对样品进行提取，获得提取液；

5、(2)样品净化：将步骤(1)所得提取液先过oasis prime hlb 6cc固相萃取柱，收集滤液后，滤液再过pribofast mfc 336固相净化柱，收集滤液获得含毒黄素的净化液；

6、对oasis prime hlb 6cc固相萃取柱进行洗涤去杂，然后洗脱，收集含米酵菌酸及异米酵菌酸的洗脱液，将含米酵菌酸及异米酵菌酸的洗脱液与含毒黄素的净化液合并；

7、(3)样品测定：采用液相色谱-串联质谱法检测步骤(2)所得产物，测定米酵菌酸、异米酵菌酸和毒黄素的含量。

8、在本发明的一些实施例中，步骤(1)中，提取液为甲醇水溶液，甲醇与水的体积比为25∶8。

9、在本发明的一些实施例中，步骤(2)中，对oasis prime hlb 6cc固相萃取柱进行洗涤去杂时使用的洗涤液为甲醇水溶液，甲醇与水的体积比为1∶1；洗脱时使用的洗脱液为甲醇。

10、在本发明的一些实施例中，步骤(3)中，先将步骤(2)所得产物吹干，所得残渣用复溶液复溶后上机检测，所述复溶液为甲醇水溶液，甲醇与水的体积比为1∶9。

11、在本发明的一些实施例中，步骤(3)中，液相色谱使用的色谱柱为acquity uplcbeh c18，

12、流动相a为含体积浓度0.1％甲酸的水，流动相b为乙腈，

13、进样量为5μl，柱温40℃，梯度洗脱程序为：

14、

15、

16、在本发明的一些实施例中，步骤(3)中，质谱扫描方式为scheduled mrm模式，其中mrm detection window为180s，米酵菌酸、异米酵菌酸和毒黄素的保留时间分别设定为5.69min、5.86min和1.19min，扫描模式分别为负离子扫描和正离子扫描。

17、在本发明的一些实施例中，质谱条件中，离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正负离子切换扫描；雾化气压力：50.0psi；辅助气压力：50.0psi；气帘气压力：40.0psi；碰撞气压力：6.0psi；离子源温度：550℃；扫描时间：50ms；碰撞室出口电压：11.0v；碰撞室入口电压：10.0v。

18、在本发明的一些实施例中，目标物的离子选择参数、保留时间、电喷雾电压分别为：

19、

20、具体的，本发明采用外标法进行所述定量分析。

21、其中，试样中米酵菌酸(异米酵菌酸)的含量计算公式为：x米＝c米×15/6，其中x米的单位为μg/kg，c米的单位为ng/ml；

22、试样中毒黄素的含量计算公式为：x黄＝c黄×15/3，其中x黄的单位为μg/kg，c黄的单位为ng/ml。

23、与现有技术相比，本技术发明具有如下优点和有益效果：

24、本发明采用液相色谱-串联质谱法，选用正负离子切换扫描方式，提出了一种食品中米酵菌酸、异米酵菌酸和毒黄素同时检测的方法。该方法可同时筛查、确证中毒样品中米酵菌酸和毒黄素，找出食物中毒的元凶，使中毒病人早期得到正确治疗。此外，该方法依据米酵菌酸和毒黄素的分子结构和理化性质，创新性地选取并优化提取、净化方法，真正意义上实现了食品中米酵菌酸和毒黄素的同时测定，测定结果准确可靠。该法检测灵敏度高，对米酵菌酸、异米酵菌酸和毒黄素的检出限分别为0.014、0.016和0.006μg/l；准确性高，优于现有检测技术，为食物中毒检测及易污染食品中极微量米酵菌酸、异米酵菌酸和毒黄素的分析测定提供可靠的技术保障。