一种同时检测白酒中41种非挥发性有机酸的方法与流程

本发明属于食品检测，具体提出一种同时检测白酒中41种非挥发性有机酸的方法。

背景技术：

1、白酒中非挥发性有机酸主要包括羟基羧酸、一元脂肪酸、二元脂肪酸、芳香族羧酸等，作为白酒风味与功能之间的重要联系物质，通过与挥发性香气物质相互作用从而影响白酒口感感知与风味释放。不同香型和产地白酒中非挥发有机酸的差异可作为白酒质量控制与差异化识别的技术工具。此外，在白酒发酵过程中，非挥发性有机酸含量变化也会影响微生态系统的ph值从而调节和平衡微生物的组成和数量，影响白酒中微量成分的代谢和风味物质的产生。并且，现有方法所能检测得到的有机酸种类较少，不利于综合判断白酒品质。因此，研究白酒中非挥发有机酸的种类与含量对于白酒品质控制与产地识别具有重要意义。

2、由于白酒中非挥发性有机酸含有羧基或羟基等极性基团，具有组成复杂、沸点高、含量低等特点，常见的液相色谱和离子色谱因其分辨率差，导致检测出非挥发性有机酸种类有限。基于气相色谱的挥发性或半挥发性物质分析平台也不适合非挥发性有机酸的痕量检测。通过修饰非挥发有机酸分子结构中活性氢原子的硅烷化技术的引入可提高有机酸的挥发性从而使其适配气相分析平台。

3、目前，白酒中非挥发性有机酸的前处理方法以直接进样、真空旋转蒸发、氮吹浓缩为主，硅烷化反应的条件以传统水浴加热为主。例如，杨会等人(杨会,范文来,徐岩.基于bstfa衍生化法白酒不挥发有机酸研究[j].食品与发酵工业,2017,43(05):192-197)采用n,o-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(bstfa)衍生化结合气相色谱质谱在白酒中共检测到27种非挥发有机酸，该方法是将20ml酒样真空旋转蒸发至1ml，取浓缩20倍的样品100μl在室温下氮气吹干，之后70℃下水浴加热3h。但由于白酒中水分含量较高，白酒酒样直接进行真空旋转蒸发或氮吹浓缩至干非常耗时，且高温水浴加热可能会导致部分有机酸衍生物分解，检测出非挥发性有机酸的种类较少，只有27种，且整个检测过程超过5h，不利于白酒样品批量检测。

技术实现思路

1、本发明专门设计了一种同时检测白酒中41种非挥发性有机酸的方法，该方法快速简单、重复性好，可为白酒中41种非挥发性有机酸的准确及快速定量检测提供科学依据。

2、本发明提出一种同时检测白酒中41种非挥发性有机酸的方法，

3、所述41种非挥发性有机酸为己酸、乙醇酸、2-羟基丁酸、草酸、2-糠酸、丙二酸单乙酯、3-羟基丙酸、3-羟基丁酸、2-羟基-3-甲基丁酸、庚酸、3-羟基异戊酸、2-羟基-4-甲基戊酸、苯甲酸、琥珀酸单乙酯、辛酸、2-羟基己酸、马来酸、琥珀酸、2,3-二羟基丙酸、富马酸、壬酸、戊二酸、3-苯丙酸、癸酸、苹果酸、己二酸、2-羟基-3-苯丙酸、4-羟基苯甲酸、月桂酸、辛二酸、香草酸、壬二酸、柠檬酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈油酸、棕榈酸、9,12-十八碳二烯酸、油酸、反油酸和硬脂酸；

4、所述方法包括如下步骤：

5、(1)准确量取白酒于离心管中，加入10-羟基癸酸溶液作为内标物，加有机萃取溶剂，涡旋，常温下避光静置后，分层得上层水相和下层有机萃取溶液；弃去上层水相，将下层有机萃取溶液在高纯氮气流下吹干后，得萃取后的非挥发性有机酸，置于离心管中；

6、(2)向步骤(1)所得含萃取后的非挥发性有机酸的离心管中，加入吡啶、双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，用封口膜密封后置于超声波清洗机中进行衍生化，将衍生后的溶液离心后，所得上层清液转移至玻璃进样瓶中，得衍生溶液；

7、(3)采用气相色谱仪-质谱联用仪对步骤(2)所得衍生溶液进行检测；

8、(4)以乙醇溶液为基质，取己酸、乙醇酸、2-羟基丁酸、草酸、2-糠酸、丙二酸单乙酯、3-羟基丙酸、3-羟基丁酸、2-羟基-3-甲基丁酸、庚酸、3-羟基异戊酸、2-羟基-4-甲基戊酸、苯甲酸、琥珀酸单乙酯、辛酸、2-羟基己酸、马来酸、琥珀酸、2,3-二羟基丙酸、富马酸、壬酸、戊二酸、3-苯丙酸、癸酸、苹果酸、己二酸、2-羟基-3-苯丙酸、4-羟基苯甲酸、月桂酸、辛二酸、香草酸、壬二酸、柠檬酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈油酸、棕榈酸、9,12-十八碳二烯酸、油酸、反油酸和硬脂酸，配制质量浓度范围在50～5000μg/l的混合系列标准工作溶液，然后按照步骤(1)～(3)所设定条件，取各标准工作溶液进行前处理之后进行gc-ms检测，以非挥发性有机酸与内标物的峰面积比为纵坐标，非挥发性有机酸的质量浓度为横坐标，绘制出每种非挥发性有机酸的标准曲线；

9、(5)将待测白酒酒样按照步骤(1)～(2)进行前处理，然后按照步骤(3)进行gc-ms检测，先通过与有机酸标准品谱图和保留时间比对进行定性分析，然后通过步骤(4)所得每种有机酸的标准曲线，对待测白酒酒样中41种有机酸进行定量分析。

10、进一步地，步骤(1)中，白酒、有机萃取溶剂的用量比为100～300μl：600～1000μl。

11、进一步地，步骤(1)中，白酒、内标物的用量比为100～300μl：50μl；

12、优选的，步骤(1)中，内标物10-羟基癸酸溶液的质量浓度为6mg/l。

13、进一步地，步骤(1)中，所述有机萃取溶剂为二氯甲烷。

14、进一步地，步骤(1)中，涡旋的时间为1～5min；

15、步骤(1)中，避光静置的时间为5～15min。

16、进一步地，步骤(2)中，超声波清洗机的超声功率为100～300w，超声温度为40～60℃，超声时间为3～8min；

17、优选的，超声波清洗机的超声功率为200w，超声温度为50℃，超声时间为5min。

18、进一步地，步骤(2)中，白酒、双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺的用量比为100～300μl：100μl；其中，双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺中含体积分数1～10％的三甲基氯硅烷。

19、进一步地，步骤(2)中，白酒、吡啶的用量比为100～300μl：400μl。

20、进一步地，步骤(3)中，采用气相色谱仪-质谱联用仪对步骤(2)所得衍生溶液进行检测时，

21、气相的分析条件：色谱柱为30m×0.25mm×0.25μm的tr-5ms毛细管色谱柱；进样口温度：250℃，进样体积：1μl，不分流进样，柱流速1ml/min，升温程序：柱温箱初始温度65℃保持2min，以5.5℃/min的升温速率升至151℃，再以6.5℃/min的升温速率升至164℃，再以5.5℃/min的升温速率升至250℃，最后以20℃/min的升温速率升至280℃保持5min；

22、质谱的分析条件：ei源，电离电压70ev，传输线温度280℃，离子源温度300℃，扫描方式：sim。

23、本发明具有以下优势：

24、本发明提出了一种基于超声辅助硅烷化结合gc-ms同时检测白酒中41种非挥发性有机酸的方法，待测酒样经二氯甲烷萃取后，直接进行高纯氮气吹干，由于二氯甲烷极易挥发，氮吹时长可缩短至15min；然后加入吡啶和bstfa后，置于超声波清洗机中进行超声辅助硅烷化反应，超声能通过自由基或自由基-离子中间体进行的均相反应加速硅烷化反应，极大缩短前处理时间，可将水浴反应时间从3h缩短至5min，极大提高了衍生效率；通过硅烷化取代非挥发性有机酸的羧基或羟基活性氢原子，降低非挥发性有机酸极性与沸点，改善气相色谱分离效果且产生有利于质谱分析的特征离子碎片；同时，设置多个升温梯度，使41种非挥发性有机酸的色谱峰实现较好分离，避免了色谱峰重合造成的积分误差；再经tr-5ms色谱柱分离后进入质谱进行检测。该方法快速简单、重复性好，可为白酒中非挥发性有机酸的准确定量检测提供科学依据。