一种越橘提取物中杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷的含量测定方法与流程

本发明属于分析化学的，具体涉及一种越橘提取物中杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷和杨梅素-3-o-半乳糖苷的含量测定方法。

背景技术：

1、越橘提取物是以欧洲越橘的新鲜冷冻果实为原料经提取加工而成的提取物，目前越橘提取物中活性成分的研究主要集中在花青素类化合物，对杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷和杨梅素-3-o-半乳糖苷这两种黄酮类化合物的研究甚少。杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷和杨梅素-3-o-半乳糖苷是植物中两种重要的黄酮类化合物，均具有强抗氧化能力，且苷元活性强于糖苷，在抗氧化、抗癌、抗糖尿病等方面均表现出比槲皮素、山柰酚等其他黄酮醇或黄酮类化合物更强的药理活性。

2、杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷和杨梅素-3-o-半乳糖苷，两者分子量相同，互为同分异构体，化学性质非常相似，同时分析两者的含量非常困难。如文献《黄酮醇糖苷与茶树品种适制性关系》食品科学2017,vol.38,no.16中使用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用仪检测了葡萄糖苷化黄酮醇与半乳糖苷化黄酮醇。色谱条件：zorbax eclipse plusc18色谱柱(150mm×3.0mm，1.8μm)；流动相a相为0.1％甲酸-水，b相为甲醇；进样量3μl；流速0.4ml/min；柱温40℃；流动相线性梯度洗脱：0min，10％ b；4min，15％ b；7min，25％ b；9min，32％ b；16min，40％ b；22min，55％ b；28min，95％ b；30min，95％ b；柱后平衡时间5min。使用上述文献分析方法测试杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷和杨梅素-3-o-半乳糖苷，图谱见图19，可见杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷半峰宽处与杨梅素-3-o-半乳糖苷相连，没有达到完全分离的要求，不能准确定量目标物。

3、越橘提取物组分复杂，现有色谱分离技术仅针对杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷单一成分的分离，尚未有杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷和杨梅素-3-o-半乳糖苷的色谱分离和同时准确定量的相关研究，使得具有优异抗氧化活力的两种黄酮类化合物在保健食品与药品中的应用受到了限制。因此开发一种专属性强，能准确定量越橘提取物中杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷和杨梅素-3-o-半乳糖苷的检测方法具有重要的研究意义。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种越橘提取物中杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷和杨梅素-3-o-半乳糖苷的含量测定方法，该方法可以消除越橘提取物中其它黄酮类物质的基质干扰，专属性强，能准确定量越橘提取物中的杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷和杨梅素-3-o-半乳糖苷的含量。

2、本发明通过如下技术方案实现：

3、一种越橘提取物中杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷和杨梅素-3-o-半乳糖苷的含量测定方法，包括如下步骤：

4、(1)将越橘提取物待测样品加入提取液提取，得供试品溶液；

5、(2)将供试品溶液采用液质联用色谱仪进行检测，采用外标法定量计算样品中杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷和杨梅素-3-o-半乳糖苷的含量；

6、其中，色谱条件为：采用t3色谱柱，以质量浓度为(0.05～0.5％)甲酸-(2～10mmol/l)乙酸铵溶液为流动相a，乙腈为流动相b进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：流动相a的起始占比90 -98％，保持2min；然后降低流动相a占比，到6min时流动相a占比80 -90％，保持至10min；然后一步降低流动相a占比，至20min时流动相a占比60-80％；然后22min迅速将流动相a占比降低到2-10％，并保持6min；然后28min迅速将流动相a占比升高到90-98％。

7、优选地，步骤(1)中，所述提取液为体积浓度为60-80％的乙醇水溶液或0.1-0.5mg/ml抗坏血酸甲醇溶液，优选为0.2mg/ml抗坏血酸甲醇溶液。

8、优选地，步骤(2)中，所述t3色谱柱的柱长为10cm，内径为2.1mm，粒径为2.5μm。

9、优选地，步骤(2)中，所述流动相a为0.1％甲酸-5mmol/l乙酸铵溶液。

10、优选地，步骤(2)中，所述梯度洗脱程序如下:

11、 时间(min) 流动相a(％) 流动相b(％) 0 98 2 2 98 2 6 90 10 10 90 10 20 78 15 22 5 95 28 5 95 30 98 2 35 98 2

12、优选地，步骤(2)中，所述柱温为25-40℃，流速为0.2-0.5ml/min。

13、优选地，步骤(2)中，所述质谱条件为：电离方式：电喷雾负离子模式；检测方式：多反应检测mrm；雾化气压力：30-40psi；离子喷雾电压：3000-4000v；干燥气温度：250-350℃；干燥气流速：8-11l/min。

14、本发明与现有技术相比，具有如下优异效果：

15、本发明方法运用液质联用仪分析技术进行分析，并通过提取液及色谱条件的优化，可以排除越橘提取物中杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷和杨梅素-3-o-半乳糖苷以外黄酮类及杂质的干扰，两个目标物分离度达到2，基线平稳，达到完全分离的要求，从而能够准确测定越橘提取物中杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷和杨梅素-3-o-半乳糖苷的含量，有利于实现对越橘提取物质量的有效控制。

16、本发明方法专属性强，其线性、精密度、耐用性试验(稳定性)、专属性试验、检出限、定量限、准确度(回收率)试验，均符合gb/t 27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，该方法科学有效，能对越橘提取物的杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷和杨梅素-3-o-半乳糖苷含量起到质量控制的目的。