基于Fe3O4@ZIF-67复合纳米酶的标记型化学发光成像免疫阵列传感器的制作方法

本发明涉及化学发光免疫分析技术，具体涉及了一种基于fe3o4@zif-67复合纳米酶的标记型化学发光成像免疫阵列传感器。

背景技术：

1、化学发光免疫分析法是结合化学发光系统和免疫反应的一种新型免疫测定技术，标记型化学发光免疫分析法采用免疫标记技术，用发光底物或催化剂(酶、金属颗粒、mof、cnts等)对抗原或抗体进行标记，并通过化学发光强度可视化分析物浓度，实现对分析物的定量检测。与传统方法相比，标记型化学发光免疫分析法具有灵敏度高、无放射性、线性范围宽、操作简单、检测时间短等特点。目前广泛应用于临床检测、农药残留、食品分析和药物检测。

2、采用天然酶标记抗体的传统化学发光免疫分析法，由于天然酶易失活、难提取及对极端条件耐受性差等缺陷限制了化学发光免疫分析法的发展。与天然酶相比，纳米酶因其优异的类酶催化活性引起广大研究人员的关注。在众多纳米材料中，具有较大比表面积、结构可调、功能多样化的金属有机框(mof)受到广泛关注。其中，沸石型咪唑骨架(zifs)作为mofs的亚类，不仅具有丰富的拓扑结构和高孔隙率，还具有优异的热稳定性和化学稳定性；由于使用与离子配位的咪唑作为连接剂，zifs可以在常温条件下快速合成，并且无需使用有毒溶剂。

3、磁性纳米颗粒作为免疫分析标签具有比表面积高、修饰工艺简单、对生物分子的干扰小等优点。将磁性fe3o4掺杂到zif-67中，fe3o4纳米颗粒中的fe(ii)可以作为电子提供者，有利于co3+/co2+的循环转化，fe3o4纳米颗粒与zif-67产生较强的协同作用，大大提高fe3o4@zif-67复合纳米酶的催化活性。

4、因此本发明的目的是提供一种基于fe3o4@zif-67复合纳米酶的标记型多元化学发光成像免疫阵列传感器，利用fe3o4@zif-67复合纳米酶代替天然酶标记二级抗体制备探针，通过形成免疫夹心复合物，结合电感耦合ccd照相机手机发光信号，实现对higg的检测。

技术实现思路

1、为了克服上述缺陷，本发明提供一种基于fe3o4@zif-67复合纳米酶的标记型化学发光成像免疫阵列传感器，具体采用如下的技术方案：

2、本发明提供了一种基于fe3o4@zif-67复合纳米酶的标记型化学发光成像免疫阵列传感器。首先制备fe3o4@zif-67复合纳米酶和fe3o4@zif-67复合纳米酶信号探针；接着将一级抗体和壳聚糖溶液均匀混合后包埋于环氧基活化载体片的免疫微孔阵列，并用牛血清蛋白bsa封闭非特异性位点后，温育相应的抗原，然后加入fe3o4@zif-67复合纳米酶标记的二级抗体(fe3o4@zif-67复合纳米酶信号探针)，温育形成三明治夹心化学发光免疫传感器。

3、进一步地，本发明提供了一种基于fe3o4@zif-67复合纳米酶的标记型化学发光成像免疫阵列传感器的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)制备fe3o4@zif-67复合纳米酶；

5、(2)制备fe3o4@zif-67复合纳米酶信号探针；

6、(3)将载玻片在水虎鱼酸中浸泡12小时，使其表面暴露羟基，用去离子水反复冲洗，自然晾干。而后将其放入含有1％ gptms的甲苯溶液中浸泡过夜，用甲苯、乙醇的顺序依次冲洗，去除表面多余的硅烷化试剂，后用氮气吹干表面负载的液体；

7、(4)根据模板，利用丝网印刷技术在可抛式的环氧硅烷化载玻片上印刷形成4排12列共48个微孔的免疫阵列；

8、(5)将等体积的壳聚糖溶液与ab1(goat anti-higg)混合；摇匀后滴入免疫阵列微孔中，在4℃下保存12小时；

9、(6)在微孔表面滴加牛血清蛋白bsa溶液，封闭未结合位点，在4℃下保存12小时，然后用磷酸缓冲溶液缓冲洗，于室温下晾干；

10、(7)将抗原溶液滴加至微孔表面与一级抗体反应，室温孵育半小时后用磷酸缓冲溶液缓慢冲洗，室温下晾干；

11、(8)将复合纳米酶探针滴入微孔表面与抗原反应形成免疫夹心复合物，室温温育半小时后用磷酸缓冲溶液缓慢冲洗，室温下晾干；

12、(9)将现配的发光底物滴入微孔表面，快速放入全自动发光成像系统检测。

13、进一步地，步骤(1)中fe3o4@zif-67复合纳米材料通过如下方法制备：

14、(a)称取2.78g feso4·7h2o和2.705g fecl3·6h2o溶解在20ml去离子水中，70℃下超声波浴，滴加40ml氨水，继续超声波浴1个小时，冷却至室温后，用去离子水离心洗涤，收集黑色产物，在60℃下真空干燥得到fe3o4；

15、(b)然后将0.006g fe3o4和2g pvp溶解15ml甲醇中，再将0.109g co(no3)2·6h2o溶解在15ml甲醇中，将两种溶液混合，再加入4.928g 2-mim和15ml甲醇，再加入25μl醋酸，超声处理20min，转移到反应釜中，放在120℃的鼓风干燥箱中反应4小时。反应结束后离心洗涤，收集固体，在60℃下真空干燥得到fe3o4@zif-67。

16、进一步地，步骤(2)中fe3o4@zif-67复合纳米酶信号探针通过如下方法制备：将步骤(1)中所得fe3o4@zif-67复合纳米酶溶于pbs中得到1ml 2mg/ml的溶液，再加入200μl0.01mol/l 11-巯基-十一烷酸(mua)溶液，常温搅拌2小时，从而在fe3o4@zif-67表面上修饰羧基，接着加入100μl 10mg/ml 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和70μl10mg/ml n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)混合溶液，再加入40μl 1mg/ml ab2(rabbit anti-higg)，在0-4℃的环境下搅拌3小时，4℃离心纯化，收集得到fe3o4@zif-67-ab2纳米信号放大探针，再分散于pbs中低温储藏。

17、进一步地，步骤(2)中fe3o4@zif-67复合纳米材料的浓度为2mg/ml，mua的浓度为0.01mol/l，edc、nhs和二级抗体的物质的量的比例为20:14:1。

18、进一步地，步骤(3)中水虎鱼酸溶液是由体积比为7：3的浓硫酸和过氧化氢溶液混合均匀配置而成。

19、进一步地，步骤(4)中借助模版印刷，将具有疏水作用的绝缘油漆均匀地刷在载玻片表面，形成疏水性无光活性膜，膜内微孔直径2mm，边缘间距4mm。

20、进一步地，步骤(5)中壳聚糖的质量浓度为0.8％，一级抗体的浓度为200μg/ml。

21、进一步地，步骤(6)中牛血清蛋白bsa溶液的质量浓度为1％。

22、进一步地，步骤(8)中复合纳米酶探针浓度为2mg/ml。

23、进一步地，步骤(9)中由5mm鲁米诺、0.6mm对碘苯酚和4mm过氧化氢配制形成发光底物；步骤(1)-(5)中磷酸缓冲溶液浓度为0.01mol/l。

24、本发明中fe3o4@zif-67复合纳米酶的合成方法简单且不易受环境影响，其比表面积大、类过氧化物酶催化活性高，能大大改善天然酶纯化成本高，易受环境影响等固有的缺陷。利用该复合纳米酶构建的标记型化学发光免疫传感器，其发光强度高并且灵敏度和稳定性大大提升。

25、本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。