用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合及应用的制作方法

本发明属于诊断检测，具体地说，涉及用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合及应用。

背景技术：

1、克罗恩病是一种致残的慢性自身免疫性疾病，随着病程的进展，消化道发生不可逆的损伤，导致严重的肠功能障碍。由于克罗恩病缺乏特异性的症状和准确的早期诊断手段，克罗恩病的诊断延迟（从首发症状到疾病诊断的时间）很常见，确诊时多已合并肠狭窄、肠瘘等并发症，错过了治疗的“黄金窗”，疾病预后差。在全球范围内，克罗恩病发病率呈上升趋势，疾病负担不可估量。由于缺乏对克罗恩病自然病程的科学认识，其早期诊断非常困难，是其预后差的主要原因之一。

2、巴黎国际专家共识（参考文献：am j gastroenterol. 2012 dec;107(12):1770-6. doi: 10.1038/ajg.2012.117.）将早期克罗恩病定义为病程在18个月内，且无并发症，没有使用过可影响疾病自然病程的药物（主要指硫唑嘌呤、氨甲蝶呤和/或生物制剂等）的克罗恩病。克罗恩病的早期诊断包括早期克罗恩病的诊断以及克罗恩病前期的识别。2015年，我国炎症性肠病专家李世荣教授率先提出克罗恩病高危人群的伺机性筛查策略（参考文献：胃肠病学，2015年第20卷第6期，doi:10．3969/j．issn．1008-7125．2015．06．001），采用该策略，本研究团队已成功建立克罗恩病早期诊断队列，并证明该策略是克罗恩病早发现(自然病程前期)和早诊断(无并发症的克罗恩病)的重要策略（参考文献：胃肠病学和肝病学杂志, 2019年1月第28卷第1期，doi:10．3969 /j．issn．1006-5709．2019．01．020；中华消化杂志, 2020年40卷05期doi：10.3760/cma.j.cn311367-20200121-00030）。

3、目前常用的克罗恩病早期诊断或筛查手段主要是结直肠镜检查、组织病理学检查、胶囊内镜检查、影像学检查和血清免疫标志物等。其中，结直肠镜检查联合组织病理学检查是克罗恩病诊断的金标准，但由于早期/前期病变的内镜下表现和组织病理学特征多不典型，通常需长期随访实现诊断，增加诊断延迟风险。此外，结肠镜检查联合组织病理学检查作为一种侵入性检查，会引起出血、疼痛等不适症状，并且对临床医师、内镜医师、病理医师的专业水平要求极高。因此，结肠镜检查联合病理学检查进行克罗恩病早诊及筛查方法的耗时费力、依从性差，急需研究新方法。胶囊内镜检查虽然是高准确性和低侵入性的检查方法，有利于发现小肠细微的粘膜病变，在小肠克罗病的早期诊断中具有较高的特异性和敏感度，但胶囊内镜检查的缺点是有滞留风险，因此，对于疑似克罗恩病，只有排除明显狭窄后，才可采用此方式检查，而且不能进行粘膜活检，鉴别诊断价值有限。此外，胶囊内镜检查价格昂贵，患者难以普遍接受。影像学检查，包括cte、mre和腹部超声等，虽有能有效观察肠壁增厚、分层、周围脂肪密度情况，但克罗恩病早期/前期病变炎性反应轻，病灶多呈局限性，消化道累及范围相对较小，限制了其在早期诊断和筛查中的应用。血清免疫标志物是指针对各种细菌表位的循环抗体，具有非侵入性、成本低的优点，但缺点是其在早期克罗恩病病中阳性率低[该专利文本数据来源的临床试验注册研究（chictr-1900022728）显示（ilabmed，doi: 10.1002/ila2.28），早期cd患者中asca igg、asca iga、ayma igg、aycaigg、fi2y igg、p-anca igg、gab igg 和pab igg 的阳性率分别为37.0%、3.7%、14.8%、25.9%、18.5%、0.0%、13.6%、7.4%]，难以单独应用进行早期诊断，即使联合诊断，其灵敏度最高也仅为87.3%（asca/ayma/ayca/fi2y/gab/pab/panca），但特异度仅为44.4%。

4、另外，近些年多组学研究（基因组学、表观基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、微生物组学等）发展迅速，一些以代谢产物、肠道菌群、小分子蛋白等为代表的血浆/血清标志物显示出对疾病早期诊断或筛查的巨大潜力，如专利文献显示（公开号：cn114965733a）：d-山梨糖醇、羟基色胺、n-乙酰基甘氨酸、胸腺嘧啶、5-羟色胺、十二烷酸、1-萘乙酸、4-硝基苯酚中的单个代谢标志物roc曲线下的面积auc值大于0.6，在0.603 -0.741之间；多个代谢标志物组合的性能明显优于单个代谢标志物，roc曲线下的面积auc值为0 .638～0 .857，并且代谢物组合诊断进展期腺瘤的灵敏度达到64％，特异性超过90％。研究或专利文献显示，基于代谢组学的代谢标志物检测低侵入性、简单、快捷且灵敏度高、特异度好的优点，有望改善当前消化道疾病早诊早治难题，如消化道早癌、炎症性肠病等。但目前，尚缺乏可用于克罗恩病早期/前期病变筛查或诊断的报道，尤其来自于基于前瞻性随访队列的临床注册研究。此外，基于血浆/血清的标志物虽具有很好的临床潜力，但样本的获取方式为有创性，患者常常因为抽取静脉血产生的疼痛或畏惧心理，容易导致患者依从性降低，而粪便因为容易获取且方便，患者更容易接受，故而研究基于粪便来源的新型标志物（如代谢物）具有广阔的临床应用前景，有望显著提高消化疾病的早期诊断率和筛查依从性，尤其是包括克罗恩病在内的炎症性肠病。

5、有鉴于此特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，基于首都卫生发展科研专项重点攻关项目《克罗恩病早期诊断的队列建立与临床标志物的组学研究》（首发2018-1-5091，临床注册号：chictr-1900022728），前瞻性地对符合克罗恩病高危条件的回盲部炎症病变（溃疡、糜烂）进行长期随访，以诊断时间为随访终点，建立不同自然病程的克罗恩病患者，在随访过程中收集患者生物样本（血液、组织、血清、粪便等）（伦理审批号：#2016-45、#2017-46)），后进行巢式队列研究以探索可用于克罗恩病早期诊断或筛查的代谢组学标志物，提供灵敏度高、特异性强的代谢标志物或最佳的联合检测组合，并创建有效、无创、价格便宜的早期诊断和筛查方法，能够很好替代传统的结肠镜检查、组织病理学检查、影像学及血清免疫标志物检测的诊断模式，减少创伤和漏诊率，提高克罗恩病早期诊断率，改善疾病预后，具备临床使用推广价值。

2、为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

3、本发明一方面提供一种用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合，所述粪便代谢标志物组合为十四烷基膦酸、4-乙酰氨基丁酸、lpe(0:0/18:2)、lpe(18:2/0:0)、甲基丙二酸、4-氧代戊酸、4-羟基异喹、n-(对甲苯甲酰基)甘氨酸、l-高精氨酸、n-棕榈酰甘氨酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸中任意至少五项组合。

4、进一步地，所述粪便代谢标志物组合包括十四烷基膦酸、4-乙酰氨基丁酸、lpe(0:0/18:2)、lpe(18:2/0:0)、甲基丙二酸。

5、进一步地，所述粪便代谢标志物组合还包括甲基丙二酸、4-氧代戊酸、4-羟基异喹、n-(对甲苯甲酰基)甘氨酸、l-高精氨酸、n-棕榈酰甘氨酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸中的至少一种。

6、进一步地，所述粪便代谢标志物组合包括4-乙酰氨基丁酸、甲基丙二酸、4-氧代戊酸、n-(对甲苯甲酰基)甘氨酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸中任意至少五项组合。

7、进一步地，所述粪便代谢标志物组合包括十四烷基膦酸、lpe(0:0/18:2)、lpe(18:2/0:0)、4-羟基异喹、l-高精氨酸、n-棕榈酰甘氨酸中任意至少五项组合。

8、本发明另一方面提供上述用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合在制备早期诊断或筛查克罗恩病的试剂盒中的应用。

9、本发明又一方面提供一种用于克罗恩病早期诊断或筛查的试剂盒，包括上述用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合的标准品。

10、进一步地，所述试剂盒还包括提取试剂和内标物。

11、进一步地，所述内标物为l-苯基丙氨酸。

12、本发明再一方面提供上述用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合的筛选方法，包括如下步骤：

13、分别采集经前瞻性克罗恩病早期诊断队列建立（中国临床试验注册中心，临床试验名称：克罗恩病早期诊断的队列建立与临床标志物的组学研究，临床注册号：chictr-1900022728）的健康对照组样本和早期克罗恩病患者组样本[该临床注册试验通过前瞻性地对符合克罗恩病高危条件的回盲部炎症病变（溃疡、糜烂）进行长期随访，以诊断时间为随访终点，建立不同自然病程的克罗恩病患者，在随访过程中收集患者生物样本（血液、粪便、组织等），后进行巢式队列研究以探索可用于克罗恩病早期诊断的组学标志物]；

14、采用lc-ms检测健康对照组样本和早期克罗恩病患者组粪便样本，经判别分析，获得候选差异代谢物；

15、对所述差异代谢物及其组合进行受试者工作特征曲线分析，确定用于早期诊断或筛查克罗恩病的代谢标志物组合。

16、在其中一些实施例中，lc-ms检测的条件为：

17、色谱柱：waters acquity uplc hss t3 c18 1 .8μm，2.1mm*100mm；

18、流动相：a 相为超纯水（0.1% 的甲酸），b 相为乙腈（0.1 % 的甲酸）；

19、洗脱梯度程序为：

20、0 min，a相与b相的体积比为95:5；

21、11.0 min，a相与b相的体积比为10:90；

22、12.0 min，a相与b相的体积比为10:90；

23、12.1min，a相与b相的体积比为95:5；

24、14.0min，a相与b相的体积比为95:5。

25、采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果。

26、本发明对比健康人群与克罗恩病患者粪便代谢组的差异性，筛选出针对克罗恩病早期诊断或筛查的12种粪便代谢物，单个代谢标志物roc曲线下的面积auc值大于0.8，在0.80~0.96之间；多个代谢标志物组合的性能明显优于单个代谢标志物，roc曲线下的面积auc值为0.89~0.99，并且代谢物组合诊断早期克罗恩病的灵敏度达到94.1%，特异度达到97.4%。采用本发明的12种粪便代谢标志物进行检测诊断时能够在降低早期诊断或筛查成本的同时提升克罗恩病诊断的灵敏度、特异度，仅通过无创性的粪便检测就能实现早期诊断，无需额外采集血液、组织等样本，能够很好地替代或减少对现有结肠镜检查、组织病理学检查、影像学检查、免疫法检测、血清免疫标志物等诊断模式或方法，减少创伤和漏诊率，提高克罗恩病患者早期诊断或筛查的依从性，极大地提高早期诊断率，具备临床使用推广价值。

27、下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。