一种检测磷酸三苯酯酶联免疫试剂盒的制备及应用的制作方法

本发明属于生物，涉及一种检测磷酸三苯酯酶联免疫试剂盒的制备方法与应用。

背景技术：

1、磷酸三苯酯(triphenyl phosphate,tphp)是常见的有机磷酸酯类化合物之一。在化工领域，常作为阻燃剂和增塑剂被广泛应用于聚氯乙烯、橡胶、纤维素树脂和乙烯基树脂等高聚物的生产中。此外，tphp作为有机磷类农药中间体，可用来制备杀虫剂。tphp不与聚合基体形成化学键，主要通过液压油的泄露与浸出、塑料制品老化挥发及工业生产过程释放到环境介质中，特别是在沉积物和天然水体中富集。而水体中的tphp可通过食物链在水生生物中积累和迁移，表现出明显的内分泌毒性、心脏毒性、神经毒性以及生殖和发育毒性。tphp对人体的暴露广泛存在，并且可通过食物链最终富集在人体内，危害身体健康。由此可见，tphp潜在的环境危害和健康风险不容忽视。

2、检测tphp含量，对保障人体安全具有重要意义。tphp在不同物质中提取方法往往不同：液体环境(如海水)中常用的方法为固相萃取法；土壤中常用的方法有索氏提取法、超声波提取法和快速溶剂萃取法等；生物组织中常用的富集方法为乙腈-超声萃取法等。tphp在不同介质中提取后，利用超高效液相色谱-串联质谱法或气相色谱-串联质谱法进行定量分析。但上述方法存在检测过程繁琐、检测时间长、有机溶剂使用量大、操作复杂和仪器昂贵等缺点，难于推广。基于单克隆抗体等生物识别材料，免疫快速筛查技术(如酶联免疫吸附法等)具有操作简便、检测时间短、无需昂贵设备、专业要求低及适合现场检测等优势，在化合物精准识别和快速筛查方面都发挥了巨大作用。然而，目前尚未见关于磷酸三苯酯免疫学检测方法的报道。

3、影响elisa检测质量的主要因素是抗原与抗体的特异性与亲和性。抗原与抗体特异性结合后，经过酶催化，可对检测物质进行定性或定量分析，并提高检测的灵敏度。抗原与抗体的特异性与亲和性取决于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分子物质残留快速检测技术的最基础、最关键的步骤。本发明提供了一种磷酸三苯酯半抗原的合成方法，并进一步合成免疫原和包被原、制备鼠单克隆抗体，最终开发了一种检测磷酸三苯酯的酶联免疫检测试剂盒。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测磷酸三苯酯的酶联免疫试剂盒，并提供一种灵敏度高、特异性强、检测成本低、适于大批量样品筛选的检测方法。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、一种检测磷酸三苯酯的酶联免疫试剂盒，由酶标板、标准品工作液、抗体工作液、酶标记工作液、样品稀释液、样品提取液、洗涤液、底物显色液和终止液组成。

4、在所述试剂盒中，所述酶标板由磷酸三苯酯半抗原与载体蛋白的偶联物包被制成。

5、所述磷酸三苯酯半抗原结构如式ⅰ所示：

6、

7、所述磷酸三苯酯半抗原制备方法如下：

8、(1)50ml反应瓶中投入680.6mg磷酸甲苯二苯酯，加入四氯化碳20ml，搅拌至溶解；

9、(2)加入过氧化苯甲酰50mg，室温搅拌10min；

10、(3)加入430mg n-溴代丁二酰亚胺，80℃回流搅拌反应16小时，降温至室温过滤除去nbs及副产物；

11、(4)滤液减压浓缩后，加入二氯甲烷溶解，溶解完全后加入2000mg100-200目硅胶拌样，200～300目硅胶装柱层析，石油醚：乙酸乙酯＝10:1洗脱，收集主产物得磷酸甲苯二苯酯甲基溴代物780mg油状物；

12、(5)50ml反应瓶中投入275mg 4-甲氨基丁酸盐酸盐，加入n-n二甲基甲酰胺15ml，搅拌至溶解后加入无水碳酸钾745mg，室温搅拌30min；

13、(6)加入630mg磷酸甲苯二苯酯甲基溴代物50℃搅拌反应16小时；

14、(7)过滤除去盐，滤液减压浓缩，加入二氯甲烷溶解，加入2000mg100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱层析，石油醚：乙酸乙酯＝1:1.5洗脱，收集主产物550mg，即式ⅰ所述半抗原化合物。

15、所述磷酸三苯酯抗原的制备方法也属于本发明的保护范围。

16、所述磷酸三苯酯抗原，为所述磷酸三苯酯半抗原(式i)与载体蛋白通过酸胺缩合反应偶联所得。

17、所述载体蛋白具体可为牛血清白蛋白(bsa)、牛甲状腺球蛋白(btg)、人血清白蛋白(hsa)、鼠血清蛋白(msa)、钥孔血蓝蛋白(klh)、兔血清蛋白(rsa)、人血清蛋白(hsa)或卵清白蛋白(ova)。

18、所述磷酸三苯酯半抗原(式i)与所述牛血清白蛋白(bsa)偶联制备磷酸三苯酯免疫原，磷酸三苯酯与牛血清白蛋白反应摩尔比为8.16：1。

19、在本发明中，所述磷酸三苯酯抗原按照如下步骤制备获得：

20、(1)免疫原：所述磷酸三苯酯(式i)8.15mg溶解于2ml二甲基甲酰胺(dmf)中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)10.3mg，n-羟基丁二酰亚胺(nhs)6.18mg，20～25℃磁力搅拌反应2～3h，得到溶液i；用5ml cb缓冲液充分溶解20mg btg后，加入溶液i，反应过夜，得到溶液ii；用磷酸盐缓冲盐溶液(0.01mol/l，ph 7.2)，于4℃对所述溶液ii搅拌透析3天，得到所述磷酸三苯酯免疫原。

21、(2)包被原：所述磷酸三苯酯(式i)20.37mg，加入2ml dmf搅拌至全部溶解，加入edc 25.75mg，nhs15.46mg，20～25℃磁力搅拌反应2～3h，得到溶液i(1)；用5ml cb液充分溶解50mg bsa蛋白后，加入溶液i(1)，反应过夜，得到溶液ii(2)；用磷酸盐缓冲盐溶液(0.01mol/l，ph 7.2)，于4℃对所述溶液ii(2)搅拌透析3天，得到所述磷酸三苯酯包被原。

22、所述酶标板为包被有磷酸三苯酯包被原的96孔板。

23、所述磷酸三苯酯抗体制备步骤如下：

24、(1)动物免疫

25、制备出的磷酸三苯酯免疫原按100μg/只注射至小鼠体内，以生理盐水溶解磷酸三苯酯抗原，与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6～8周龄balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天将免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。

26、(2)细胞融合与克隆

27、按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(sp2/0)混合，然后在45s内缓慢加入预热的融合剂(peg 4000)进行融合，用hat培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％co2培养箱中培养，5天后用ht培养基半换液，9天后进行全换液。

28、细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接elisa方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠igg-hrp和igm-hrp，opd邻苯二胺被氧化后发生显色反应。根据显色反应筛选出的阳性孔再用间接竞争elisa方法筛选，先将细胞上清与100μg/ml的磷酸三苯酯等体积混合，37℃水浴30min，再加入到包被好的酶标板中。对照组用pbs取代磷酸三苯酯，其余步骤同上。若经磷酸三苯酯阻断后的od 450nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2～3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。

29、(3)单克隆抗体的制备及纯化

30、将2～3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接elisa测定效价，冻存；并取8～10周龄balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml/只，7～10日后腹腔注射杂交瘤细胞1～2×105/只，7～10日后抽取小鼠腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法对其进行纯化，取上清得到纯化的磷酸三苯酯药物的单克隆抗体。

31、在所述试剂盒中，所述标准品工作液的溶剂为含有光稳定剂、牛血清白蛋白的pbs缓冲液，溶质为磷酸三苯酯；所述溶质在所述6种标准品工作液中的浓度分别为0μg/l、0.01μg/l、0.03μg/l、0.09μg/l、0.27μg/l、0.81μg/l和2.43μg/l；所述pbs缓冲液同抗体稀释液pbs缓冲液，ph值为7.2。

32、在所述试剂盒中，所述磷酸三苯酯抗体工作液为将磷酸三苯酯的特异系单克隆抗体用抗体稀释液稀释9000倍所得。

33、所述抗体稀释液为含有牛血清白蛋白、明胶、防腐剂proclin-300、tween-20和tris的pbs缓冲液；所述抗体稀释液的溶剂为去离子水，溶质为牛血清白蛋白、明胶、防腐剂proclin-300、tween-20、tris、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠和氯化钾；所述牛血清白蛋白、明胶、防腐剂proclin-300、tween-20和tris在去离子水中浓度分别为2.5％、0.1％、0.02％、1ml/l和0.1g/l；所述pbs溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠和氯化钾，所述溶质在去离子水中浓度分别为1.44g/l、0.24g/l、8.0g/l和0.3g/l。

34、在所述试剂盒中，所述酶标记物工作液为将辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,hrp)标记的羊抗鼠二抗用二抗稀释液稀释500倍获得。

35、所述二抗稀释液为含有胎牛血清、丙三醇和proclin 300的pbs缓冲液；所述pbs缓冲液配制方法同上；所述胎牛血清、丙三醇和proclin 300在所述pbs缓冲液中的浓度分别为200ml/l、50ml/l和1ml/l。

36、在所述试剂盒中，所述样品稀释液为含有光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂的pbs缓冲液；所述pbs缓冲液配制方法同上；光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂在所述pbs缓冲液中的浓度分别为0.2g/l、0.1g/l和0.1g/l，ph值为7.2。

37、在所述试剂盒中，所述样品提取液为含有光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂的pbs缓冲液；所述pbs缓冲液配制方法同上；光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂在所述pbs缓冲液中的浓度分别为0.2g/l、0.1g/l和0.2g/l，ph值为7.2。

38、在所述试剂盒中，所述洗涤液为含有tween-20和proclin 300的pbs缓冲液；所述pbs缓冲液配置方法同上；tween-20和proclin 300所述pbs缓冲液中的浓度分别为20ml/l和300μl/l。

39、在所述试剂盒中，所述底物显色液为1.0g/l过氧化脲、5.0g/l乙酸钠、0.5g/l光稳定剂、2.5ml/l磷酸、5.0g/l四甲基联苯胺的混合水溶液，溶剂为去离子水。

40、在所述试剂盒中，所述终止液为0.05mol/l的硫酸水溶液。

41、本发明的另一目的是提供一种检测样品中磷酸三苯酯的方法，包括如下步骤：

42、(1)对样品进行前处理获得所述样品的溶液；

43、(2)使用上述试剂盒对溶液进行检测；

44、(3)分析检测结果。

45、所述样品前处理方法如下：准确称取1±0.1g(或ml)样品加入5ml样品提取液，室温(25±2℃)高速涡动1min，5000g离心5min，取200μl上清液加入200μl样品稀释液，充分震荡混匀后待测。

46、所述试剂盒检测步骤如下：向包被有所述磷酸三苯酯抗原的酶标板中加入50μl标准品工作液或所述样品前处理液，之后加入含磷酸三苯酯的特异性抗体溶液；温育后加入洗涤液洗涤4次，充分拍干后加入酶标记抗抗体，显色10min后加入终止液，使用酶标仪测定溶液在450nm和620nm处吸光值。

47、本发明提供的检测结果分析过程为：用所获得的每个浓度的标准品工作液的吸光度平均值(b)除以第一个标准溶液(0ng/ml标准)的吸光度值(b0)再乘以100％，即百分吸光度值。计算公式为：百分吸光度值(％)＝(b/b0)×100％。

48、以磷酸三苯酯标准品工作液的浓度(μg/l)的半对数值为x轴，百分吸光度值为y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度则可从标准曲线上读出样本中磷酸三苯酯的含量。

49、本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。

50、本发明所提供的磷酸三苯酯半抗原，以及所述磷酸三苯酯抗原，合成方法简单、纯度高、产率高，对于磷酸三苯酯抗体的制备，以及磷酸三苯酯药物残留检测具有重大价值。

51、本发明所述检测磷酸三苯酯酶联免疫吸附试剂盒原理为：样品中的磷酸三苯酯与酶标板上固定的抗原特异性竞争，加入酶标二抗，与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色深浅判断样品中磷酸三苯酯的含量。检测吸光度与样品所含磷酸三苯酯含量成负相关，将吸光度代入标准曲线，在乘以其对应的稀释倍数，即可得到样品中磷酸三苯酯的残留量。