一种虫草类药材中虫草酸的检测方法与流程

本发明涉及药材药物成分检测领域，具体涉及一种虫草类药材中虫草酸的检测方法。

背景技术：

1、冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌cordyceps sinensis(berk.)sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体。虫草为一类具有悠久药用历史的中药材，其由真菌侵染昆虫，并从其头部或体表长出子座而形成的虫菌复合体。其中冬虫夏草为最为著名的虫草类药材，其气微腥，味微苦，性甘、平，归肺、肾经，具有补肾益肺、止血化痰的功效。虫草类药材中含有丰富的氨基酸、核苷酸、虫草酸、虫草多糖、脂肪酸等多种生物活性成分，其中虫草酸为虫草类药材中含量较高的活性成分，具有利尿、镇咳、祛痰和平喘等多种功效，常被作为该类中药材的质量评价指标。

2、目前虫草酸的含量测定主要方法有氧化还原滴定法、分光光度法和高效液相法等。其中2020版《中国药典》中“百令胶囊”中根据虫草酸的还原性采用氧化剂进行滴定，测定样品具有还原羟基成分的总和，该法适用于较纯的虫草酸制剂的测定，对于成分复杂多样的虫草类样品易造成结果偏高。前期也有文献报道使用分光光度法测定虫草酸含量，但分光光度法受类似糖醇的干扰较大，灵敏度和准确性较低，应用具有一定的局限性。高效液相色谱法具有更好的专属性，适合于复杂样品的虫草酸分析。然而，文献已报道的高效液相色谱分析方法存在杂质干扰大、分析时间长、专属性差、灵敏度低等缺点，因为水提物中往往含有大量其他的大极性物质，影响固定相和流动相的选择，进而影响定量分析的精准性。因此，仍亟需一种灵敏度高，分离度好，杂质干扰小，检测时间短，操作简便的虫草类药材中虫草酸的检测方法。

技术实现思路

1、针对现有技术方法的不足，本发明建立了一种将虫草酸与虫草中其他其化学成分分离开来，并利用高效液相色谱仪快速检测虫草类药材中虫草酸含量的方法，该方法在5min内即可完成样品的分析(1min样品提取，4min色谱分析)，具有灵敏度高，分离度好，操作简便，分析快速，重复性好，专属性高的优点，并适用于冬虫夏草、发酵冬虫夏草菌粉、发酵虫草菌粉、蝉花或蛹虫草等虫草类药材中虫草酸的定量分析，本发明结果为虫草类药材的快速质量评价提供了技术支撑。

2、本发明提供了一种虫草类药材中虫草酸的检测方法，其包括：采用液相色谱法，检测虫草类药材中虫草酸含量；液相色谱仪的检测器为蒸发光散射检测器，所述液相色谱法所采用的流动相为含添加剂的乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为90:10-95:5。

3、在一些实施例中，所述添加剂为甲酸或乙酸。在一些实施例中，所述添加剂为乙酸和乙酸铵。在一些优选的实施例中，所述添加剂为甲酸和乙酸铵。

4、在一些实施例中，以所述流动相的总体积计算，所述乙酸铵的含量为0.5mm-1.5mm。在一些实施例中，以所述流动相的总体积计算，所述乙酸铵的含量为1.0mm。

5、在一些实施例中，以所述流动相的总体积计算，所述乙酸的含量为0.05％vol-0.2％vol。在一些实施例中，以所述流动相的总体积计算，所述乙酸的含量为0.1％vol-0.2％vol。在一些实施例中，以所述流动相的总体积计算，所述乙酸的含量为0.1％vol。

6、在一些实施例中，以所述流动相的总体积计算，所述甲酸的含量为0.05％vol-0.2％vol。在一些实施例中，以所述流动相的总体积计算，所述甲酸的含量为0.1％vol-0.2％vol。在一些实施例中，以所述流动相的总体积计算，所述甲酸的含量为0.05％vol、0.1％vol、0.15％vol或0.2％vol。在一些实施例中，以所述流动相的总体积计算，所述甲酸的含量为0.1％vol。

7、在一些实施例中，以所述流动相的总体积计算，所述乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为95:5，所述添加剂为甲酸或乙酸。

8、在一些实施例中，以所述流动相的总体积计算，所述乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为95:5，所述添加剂为乙酸和乙酸铵。

9、在一些实施例中，以所述流动相的总体积计算，所述乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为95:5，所述添加剂为乙酸和乙酸铵，以所述流动相的总体积计算，所述乙酸的含量为0.1％vol，所述乙酸铵的含量为1.0mm。

10、在一些优选的实施例中，以所述流动相的总体积计算，所述乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为95:5，所述添加剂为甲酸和乙酸铵。

11、在一些优选的实施例中，以所述流动相的总体积计算，所述乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为95:5，所述添加剂为甲酸和乙酸铵，以所述流动相的总体积计算，所述甲酸的含量为0.1％vol-0.2％vol，所述乙酸铵的含量为1.0mm。

12、在一些实施例中，所述检测方法还包括供试品溶液的制备，所述供试品溶液的制备方法包括：取虫草类药材粉末，加入提取溶剂，超声提取，静置至室温，加入提取溶剂补足超声提取损失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，得到所述供试品溶液。

13、在一些实施例中，所述检测方法还包括对照品溶液的制备，所述对照品溶液使用提取溶剂进行制备。

14、在一些实施例中，所述提取溶剂为乙醇溶液或水。

15、在一些实施例中，所述供试品溶液的制备方法中每1g所述虫草类药材粉末的质量投料提取溶剂的体积为50ml-250ml。在一些优选的实施例中，每1g所述虫草类药材粉末的质量投料提取溶剂的体积为100ml。

16、在一些实施例中，所述乙醇溶液为含10％vol-50％vol乙醇的乙醇水溶液。在一些实施例中，所述乙醇溶液为含10％vol、15％vol、20％vol、25％vol、30％vol、35％vol、40％vol、45％vol或50％vol乙醇的乙醇水溶液。

17、在一些优选的实施例中，所述乙醇溶液为含30％vol乙醇的乙醇水溶液。

18、在一些实施例中，所述超声提取的超声时间为1min–30min。在一些实施例中，所述超声提取的超声时间为1min、5min、10min、15min、20min、25min或30min。

19、在一些实施例中，所述液相色谱法的色谱柱为agilent poroshell 120hilic。

20、在一些实施例中，所述色谱柱的长度为50mm-150mm。在一些实施例中，所述色谱柱的长度为50mm、100mm或150mm。

21、在一些实施例中，所述色谱柱的内径为2.0mm-5.0mm。在一些实施例中，所述色谱柱的内径为2.1mm、3.0mm或4.6mm。

22、在一些实施例中，所述色谱柱的填料的粒径为1.8μm-4.0μm。在一些实施例中，所述色谱柱的填料的粒径为1.9μm、2.7μm、或4.0μm。在一些实施例中，所述色谱柱的填料的粒径为2.7μm。

23、在一些实施例中，所述色谱柱的规格为50mm×4.6mm，2.7μm。

24、在一些实施例中，所述蒸发光散射检测器的漂移管温度为30℃-75℃，载气压力为3.4bar-3.6bar；分析时间为3min-6min。在一些实施例中，所述蒸发光散射检测器的漂移管温度为45℃，载气压力为3.5bar；分析时间为4min。

25、在一些实施例中，所述载气为氮气。

26、在一些实施例中，所述流动相的流速为1.0ml/min-1.5ml/min。在一些实施例中，所述流动相的流速为1.0ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min、1.3ml/min、1.4ml/min或1.5ml/min。

27、在一些实施例中，所述液相色谱法中柱温为20℃-30℃。在一些实施例中，所述液相色谱法中柱温为22℃-27℃。在一些实施例中，所述液相色谱法中柱温为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃。在一些实施例中，所述液相色谱法中柱温为25℃。

28、在一些实施例中，所述检测方法包括：采用液相色谱法，检测虫草类药材中虫草酸含量；液相色谱仪的检测器为蒸发光散射检测器，所述液相色谱法所采用的流动相为含添加剂的乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为90:10-95:5；所述添加剂为甲酸或乙酸；以所述流动相的总体积计算，所述乙酸的含量为0.05％vol-0.2％vol或者0.1％vol-0.2％vol；所述甲酸的含量为0.05％vol-0.2％vol或者0.1％vol-0.2％vol；所述液相色谱法的色谱柱为agilent poroshell 120hilic；所述色谱柱的规格为50mm×4.6mm，2.7μm；所述流动相的流速为1.0ml/min-1.5ml/min(例如1.0ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min、1.3ml/min、1.4ml/min或1.5ml/min)；所述液相色谱法中柱温为20℃-30℃(例如20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃)。

29、在一些实施例中，所述检测方法包括：采用液相色谱法，检测虫草类药材中虫草酸含量；液相色谱仪的检测器为蒸发光散射检测器，所述液相色谱法所采用的流动相为含添加剂的乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为90:10-95:5；所述添加剂为乙酸和乙酸铵，以所述流动相的总体积计算，所述乙酸铵的含量为0.5mm-1.5mm或1.0mm；所述乙酸的含量为0.05％vol-0.2％vol或者0.1％vol-0.2％vol；所述液相色谱法的色谱柱为agilent poroshell 120hilic；所述色谱柱的规格为50mm×4.6mm，2.7μm；所述流动相的流速为1.0ml/min-1.5ml/min(例如1.0ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min、1.3ml/min、1.4ml/min或1.5ml/min)；所述液相色谱法中柱温为20℃-30℃(例如20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃)。

30、在一些优选的实施例中，所述检测方法包括：采用液相色谱法，检测虫草类药材中虫草酸含量；液相色谱仪的检测器为蒸发光散射检测器，所述液相色谱法所采用的流动相为含添加剂的乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为90:10-95:5；所述添加剂为甲酸和乙酸铵，以所述流动相的总体积计算，所述甲酸的含量为0.05％vol-0.2％vol或者0.1％vol-0.2％vol；所述乙酸铵的含量为0.5mm-1.5mm或1.0mm；所述液相色谱法的色谱柱为agilent poroshell 120hilic；所述色谱柱的规格为50mm×4.6mm，2.7μm；所述流动相的流速为1.0ml/min-1.5ml/min(例如1.0ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min、1.3ml/min、1.4ml/min或1.5ml/min)；所述液相色谱法中柱温为20℃-30℃(例如20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃)。

31、在一些实施例中，所述虫草类药材包括冬虫夏草、发酵冬虫夏草菌粉、发酵虫草菌粉、蝉花或蛹虫草。

32、有益效果

33、相比现有技术，本发明包括以下有益效果：

34、(1)相比采用不添加添加剂的乙腈水溶液作为流动相，采用添加了甲酸或乙酸，乙酸和乙酸铵，或者甲酸和乙酸铵的乙腈水溶液作为流动相更有利于显著提高虫草酸在elsd检测器中的响应，具有预料不到的技术效果。

35、(2)本发明所提供的方法具有灵敏度高，分离度好，操作简便，分析快速，重复性好，专属性高，准确度高，精密度高(重现性好)，线性好，杂质干扰小等优点。

36、术语说明

37、在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

38、术语“室温”表示环境温度，指温度在大约10℃至大约30℃，或大约20℃至30℃，或大约25℃。

39、在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

40、术语“v/v”表示体积比。

41、术语“％vol”表示体积百分比。

42、术语“料液比”表示待提取物料的质量与提取溶剂的体积之比，例如1g:100ml的料液比表示每1g待提取物料采用100ml提取溶剂进行提取。

43、在下面的内容中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％、15％或20％等差异。每当公开一个具有n值的数字时，任何具有n+/-1％,n+/-2％,n+/-3％,n+/-5％,n+/-7％,n+/-8％,n+/-10％,n+/-15％or n+/-20％值的数字会被明確地公开,其中“+/-”是指加或减。