His-tag标签蛋白浓度标准曲线的制备方法及其应用与流程

本发明具体涉及基于生物膜干涉技术(bio-layer interaction，bli)的高通量检测建立his-tag标签蛋白浓度标准曲线的方法以及该浓度标准曲线在his-tag标签蛋白浓度检测中的应用。

背景技术：

1、运用基因重组技术生产的蛋白质数量和种类越来越多，其中在重组蛋白质末端添加亲和“标签”的技术最常见。his标签是基因重组技术中经常用到的一种标签，其序列为六个组氨酸hhhhhh。his标签的特点是分子量小，基本不改变蛋白质的生物结构，不改变蛋白质的溶解性，更重要的是使蛋白质的纯化变得极为方便，根据组氨酸上的咪唑环可以与二价金属离子结合的原理，人们可以利用金属离子亲和层析技术纯化带有his标签的蛋白。

2、his标签蛋白作为一种生物制品，在研发、生产阶段均需要进行蛋白含量检测。特别是在研发早期，需要对蛋白表达情况进行大量筛选。目前，his-tag标签蛋白的传统检测方法是免疫印迹法(western blotting)或酶联免疫吸附法(enzyme linkedimmunosorbent assay，elisa)。

3、免疫印迹法是一种将高分辨电泳和免疫化学分析技术相结合的复杂技术。该方法主要是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质；以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该方法可以用于蛋白质表达的初步评估，但不能进行准确定量，并且对实验员要求高，操作步骤复杂，检测周期长及检测通量低，不满足研发早期大量检测的需求。

4、酶联免疫吸附法将已知的抗原或者抗体包被在96孔微孔板上，待检测的样品被其捕获后，洗涤未结合的样品；再加入酶标记的二抗与抗体或者抗原-样品复合物结合，洗涤后加入酶催化底物使之变色，颜色的深浅与待检样品的浓度呈线性关系。酶联免疫吸附实验虽然克服了免疫印迹定量不准确及检测通量低的问题，但是仍然存在对实验人员要求高，操作步骤繁琐，实验周期长，实验结果准确性及重复性差的缺陷。

5、生物膜干涉技术(bio-layer interaction，bli)是近年来出现的一种分子相互作用技术。原理是通过在光纤制成的生物传感器底端覆盖生物分子相容层，固定相互作用分子中的一种，形成新的具有反应特异性的生物膜层。当生物膜层与另一种分子结合时，生物层厚度增加，反射光干涉光谱曲线产生可测量的变化，通过检测这种位移变化来反映蛋白分子的浓度。该技术通量高、操作简便、检测快速、灵敏度高、结果准确。但是现有的生物膜干涉技术多用于检测分子间的相互作用，对定量测量蛋白浓度方面没有明确的应用。

技术实现思路

1、有鉴于此，为了克服现有技术的缺陷以及实现上述目的，本发明提供了一种基于bli技术his-tag标签蛋白浓度标准曲线的制备方法。

2、一种his-tag标签蛋白浓度的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：制备固化蛋白溶液；制备浓度标准曲线，并将待测样品制备成样品溶液；利用proteina传感器捕获固化蛋白溶液中的固化蛋白，之后利用固化有所述固化蛋白的proteina传感器捕获样品溶液内的his-tag标签蛋白并进行检测，将检测结果代入所述浓度标准曲线中，得到待测样品中的his-tag标签蛋白浓度。

3、利用bli技术检测his-tag标签蛋白，首先用proteia传感器捕获合适浓度的抗his-tag抗体(含fc区域，可以与proteina结合)；然后再与不同浓度的his-tag标签蛋白结合；结合在生物传感器上的生物分子形成一层生物膜，此生物膜对透过传感器的可见光造成干涉现象，干涉现象以干涉光谱的位移的方式被检测到，通过蛋白的结合速率对蛋白进行浓度定量。

4、由于his-tag标签蛋白(多聚组氨酸标签蛋白)不带有fc可结晶段(fragmentcrystallizable，fc)，无法用proteina传感器直接捕获，所以采用固化蛋白的间接方法进行捕获和检测。通过这样的方法，不仅样品制备简单，待测样品只需进行简单离心或者稀释后，直接检测；且无需标记、无需显色反应，即可进行样品检测，避免标记试剂或者显色试剂对环境的污染；检测全过程没有包被抗体、反复加样、反复加试剂、反复洗板操作；设备参数设置完成即可上样检测，实验流程简便、易于实验人员操作；能够实现高通量、提高检测效率，实现大量样品批量检测；整个实验过程操作步骤简单，外界因素对实验结果影响较小，保证了实验结果的准确可靠及可重复性；同时选取proteina传感器能够实现传感器的再生的回收，实现传感器的重复利用。

5、根据本发明的一些优选实施方面，所述浓度标准曲线的制备包括如下步骤：用稀释液将固化蛋白稀释到浓度为5μg/ml～20μg/ml；利用proteina传感器捕获不同浓度的固化蛋白溶液中的固化蛋白，根据固化蛋白的固化高度(bingding，单位nm；在一定的固化时间)选择合适的固化蛋白的浓度；在所述合适的固化蛋白的浓度下，将标准品进行系列稀释，并利用固化有固化蛋白的proteina传感器捕获标准品中的标签蛋白并进行检测，根据检测结果通过设备分析软件data analysis 11.1自动拟合建立浓度-结合速率的标准曲线。

6、根据本发明的一些优选实施方面，稀释后的所述标准品浓度范围为0.3906μg/ml～50μg/ml。

7、根据本发明的一些优选实施方面，所述合适的固化蛋白的浓度为10～15μg/ml。

8、根据本发明的一些优选实施方面，固化蛋白的固化高度为≥1.0nm。

9、根据本发明的一些优选实施方面，所述检测方法包括传感器的再生步骤：将检测了样品的传感器先经过甘氨酸浸洗再生5～10s，再用稀释液进行复性操作5～10s，再生和复性操作各进行多次。

10、根据本发明的一些优选实施方面，所述检测方法包括传感器的保存步骤：实验完全结束后，将proteina传感器在蔗糖溶液中浸泡至少30s，之后烘干并室温密封保存。

11、根据本发明的一些优选实施方面，所述固化蛋白为抗his-tag抗体固化蛋白，包括anti-his tag rabbit pab和/或anti-6his tag antibody。

12、根据本发明的一些优选实施方面，所述检测为利用生物分子相互作用分析系统进行检测。

13、根据本发明的一些优选实施方面，所述稀释液为含0～0.02％tween20和0～0.1％bsa的pbs溶液，ph为7.4。

14、由于采用了以上的技术方案，相较于现有技术，本发明的有益之处在于：本发明的his-tag标签蛋白浓度标准曲线的制备方法，基于生物膜干涉技术原理，样品制备简单，只需进行简单离心或者稀释后，直接检测；且无需标记、无需显色反应，即可进行检测，避免标记试剂或者显色试剂对环境的污染；检测全过程没有包被抗体、反复加样、反复加试剂、反复洗板操作；设备参数设置完成即可上样检测，实验流程简便、易于实验人员操作；通过建立his-tag标签蛋白浓度标准曲线，后续基于相同的原理进行样品检测，能够实现高通量、提高检测效率，实现大量样品批量检测；整个实验过程操作步骤简单，外界因素对实验结果影响较小，保证了实验结果的准确可靠及可重复性。