基于CRISPRCas-便携式检测仪-智能手机的可视化定量检测平台及其应用

本发明涉及病原体检测，更具体地，涉及基于crispr cas-便携式检测仪-智能手机的可视化定量检测平台及其应用。

背景技术：

1、最近，基于crispr cas检测方法的检测系统得到了广泛的认可，与pcr及传统检测技术相比，crispr cas生物传感系统所特有的侧支分裂活性具有信号放大功能，可进一步增强其高灵敏度和超快生物传感能力，同时该生物传感系统可以与等温加热装置与信号输出组件相结合，进而开发快速、多功能的即时检验检测技术。

2、crispr cas生物传感系统主要包括crispr cas9、crispr cas12、crisp r cas13和crispr cas14这四个系统。现有的研究主要集中于使用crispr cas12a检测病毒，也有科学家使用crispr cas系统检测病原菌及其耐药基因和毒力基因。

3、近年来，越来越多由病原微生物引发的疾病快速流行及迅速传播，病原体的快速、准确检测对更好的控制疾病源头，避免大范围传播起到了举足轻重的作用。现有的检测方法，结果需要借助qpcr仪，酶标仪，拉曼光谱检测仪等大型仪器识别并呈现，可以定量分析结果，但是对操作人员有极高的要求，使其不利于病原体的临床现地检测，且容易产生非特异性扩增，对实验结果造成影响。因此，越来越需要开发一种能够应用于病原体的临床现地检测的检测方法。

4、现阶段，智能手机在分析检测领域发挥越来越大的作用。它不仅可以用来拍摄记录实验结果，还可以调取小程序或app直接对图片进行分析，针对不同的需求开发不同的应用程序，可以实现检测的数字化、可视化、微型化、便捷化，进一步应用于食品药品监督、环境监测及医疗诊断等检测领域。

5、综上所述，crispr cas检测方法在新发疾病快速检测方面具有巨大潜力，但是目前并没有一种便携式的检测装置，能够使用crispr cas检测方法并配合智能手机进行实时、定量和快速的智能化检测。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供基于crispr cas-便携式检测仪-智能手机的可视化定量检测平台及其应用。

2、本发明的第一个目的是提供一种基于比色法crispr cas的可视化定量检测平台。

3、本发明的第二个目的是提供一种基于比色法crispr cas的可视化定量检测平台在非疾病治疗诊断中的应用。

4、本发明的第三个目的是提供一种基于比色法的可视化定量检测的便携式检测仪。

5、为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

6、一种基于比色法crispr cas的可视化定量检测平台，包括基于比色法的可视化定量检测的便携式检测仪、crispr cas反应体系、图像采集设备以及图像数据处理程序，所述基于比色法的可视化定量检测的便携式检测仪包括可密闭的箱体(2)、电源(4)和用于支撑拍摄用图像采集设备的支架(5)，所述箱体(2)的上板与下板平行，箱体(2)的上板设置有观察窗，观察窗上设置有滤光片(1)，下板上设置有样品放置区(8)，所述图像采集设备通过观察窗拍摄放置于样品放置区(8)的待测样品，得到待测样品荧光图像；箱体(2)两侧壁还设置有可开合的送样口(3)；箱体(2)内部两侧面相向设置有照射样品放置区(8)的两组平行的带状光源(7)；带状光源(7)通过不透光的连接板(6)与箱体连接，所述连接板(6)分别位于箱体两个侧壁，两组带状光源(7)的安装面与侧壁之间的夹角θ呈15°～60°；所述图像处理程序可将所述待测样品荧光图像中的荧光部分转换为rgb数值中的g值，并将g值结果代入线性拟合回归曲线中，输出数值，所述线性拟合回归曲线是根据待检基因dna标准品浓度与g值的关系绘制得到的。

7、优选地，所述crispr cas反应体系包括crrna，所述crrna的核苷酸序列如下面的任一组所示：seq id no：1～2、seq id no：7～8、seq id no：13～14、seq id no：19～20、seq id no：25～26、seq id no：31～32或seq id no：37～38。

8、更优选地，所述crispr cas反应体系还包括crispr cas核酸酶、10×cas核酸酶buffer、荧光标记的ssdna、rnase inhibitor和无酶水。

9、更优选地，所述crispr cas核酸酶为lbcpf1。

10、进一步更优选地，所述10×cas核酸酶buffer为10×lbcpf1 buffer。

11、最优选地，所述crispr cas反应体系为crispr cas12a反应体系。

12、进一步最优选地，所述crispr cas12a反应体系包括crrna、10×lbcpf1buffer、lbcpf1、荧光标记的ssdna、rnase inhibitor和无酶水。

13、优选地，所述荧光标记的ssdna的5’端为fam标记，3’端为bhq标记。

14、更优选地，所述荧光标记的ssdna的核苷酸序列如seq id no：43所示。

15、优选地，所述图像采集设备为智能手机。

16、更优选地，所述图像采集设备为华为、苹果或小米任一品牌的智能手机。

17、优选地，所述线性拟合回归曲线为y＝0.1512x+161.3。

18、所述可视化定量检测平台在非疾病诊断或治疗目的的检测中的应用也应在本发明的保护范围之内，所述可视化定量检测平台的检测步骤为：

19、s1.提取待测样本的基因组dna，与所述crispr cas反应体系混合后，置于28～37℃恒温反应10～30min，得到反应后样品；

20、s2.将反应后样品置于所述基于比色法的可视化定量检测的便携式检测仪中，使用图像采集设备拍摄所述便携式检测仪中的反应后样品，得到比色结果图；

21、s3.将比色结果图中反应后样品的荧光部分转换为rgb数值中的g值，将g值结果作为x值带入线性拟合回归曲线中，进行定量分析，所述线性拟合回归曲线是根据待检基因dna标准品浓度与g值的关系绘制得到的。

22、优选地，步骤s1中，100℃加热待测样本10min，提取待测样本的基因组dna。

23、优选地，步骤s1中，所述crispr cas反应体系为crispr cas12a反应体系。

24、更优选地，步骤s1中，提取待测样本的基因组dna，与所述crispr cas反应体系混合后，置于37℃恒温反应30min，得到反应后样品。

25、最优选地，所述待测样本为含肺炎克雷伯菌的样本。

26、优选地，步骤s2中，所述图像采集设备为智能手机。

27、优选地，步骤s3中，所述线性拟合回归曲线为y＝0.1512x+161.3。

28、优选地，所述可视化定量检测平台在非疾病诊断或治疗目的的检测，为检测病原体基因。

29、更优选地，所述病原体基因为肺炎克雷伯菌(k.p.)毒力基因rmpa、iuca、irob、peg344基因家族和耐药基因blandm、blakpc、blaoxa48基因家族。

30、所述基于比色法的可视化定量检测的便携式检测仪也应在本发明的保护范围之内。

31、优选地，所述带状光源(7)为470nm蓝色光源或620～750nm红色光源。

32、优选地，所述带状光源(7)与下板的距离为3～6.5cm。

33、优选地，所述带状光源(7)均为平行设置的1～6条恒压led灯带。

34、更优选地，所述带状光源(7)均为平行设置的6条恒压led灯带，左右两侧灯带中心点距底面距离分别为3cm、3.6cm、4.4cm、5.2cm、5.8cm和6.5cm。

35、优选地，所述带状光源(7)的对称轴与箱体(2)的上板和下板垂直。

36、优选地，所述两组平行的带状光源(7)串联后串联于所述电源(4)，所述电源(4)为5～12v恒压电源。

37、更优选地，所述两组平行的带状光源(7)的灯珠串联在恒压led灯带中。

38、进一步更优选地，所述电源(4)为5v恒压电源。

39、最优选地，所述电源(4)为5v恒压电池。

40、优选地，所述连接板(6)分别位于箱体两个侧壁，两组带状光源(7)的安装面与侧壁之间的夹角θ呈30°。

41、优选地，所述箱体(2)为9.9～10.4cm×9.9～10.1cm×9.9～10.1cm的长方体。

42、最优选地，所述箱体(2)为10cm×10cm×10cm的立方体。

43、优选地，所述样品放置区(8)位于下板中心线位置。

44、优选地，所述样品放置区(8)可放置装有样品的pcr管或酶标板等。

45、所述便携式检测仪在基因定量和/或分析系统中的应用也应在本发明保护范围之内。

46、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

47、本发明所述的便携式检测仪制备工艺简单，原料易得且便于携带，使用本发明请求保护的便携式检测仪配合智能手机中的图像数据处理程序进行检测，在一定范围内，病原体基因组dna的浓度与荧光值具有线性关系，通过图像数据处理程序借助算法将不同荧光颜色的图片结果数值化，代入标准曲线即可完成对临床样品中病原体基因的快速定量检测，能够脱离传统的qpcr、酶标仪和拉曼光谱检测仪等大型设备，对实时恒温反应后的实验样本进行定量检测。而且，不同操作系统的手机均适用于本发明请求保护的便携式检测仪，无需额外的设备或复杂的操作，还能利用手机的网络连接，实现远程数据传输，方便实时监测和远程协作。同时，还能直观地呈现定量检测结果，提供更直观的数据展示和分析。

48、本发明请求保护的可视化定量检测平台中包含crispr cas 12a检测体系，检测对象即热裂解获得的病原体基因组dna，当待检测样品中有靶标dna存在时，特定的crrna会引导cas12a酶对其切割，同时激发cas12a酶的反式切割活性，进而切割体系内的单链dna。因此，使用本发明请求保护的检测平台检测病原体基因时，在热裂解法一步提取dna后，无需恒温扩增放大检测信号，即可使用所述crispr cas 12a检测体系和所述便携式检测仪进行检测，检测时长最低仅需10分钟，相比传统的病原体检测方法，检测速度快；简化了实验流程，检测体系内不易产生非特异性扩增。

49、本发明基于crispr cas12a-智能手机的可视化定量检测平台，可以在实验室以外的场景进行检测，实现临床快速现地检测，提高了病原体检测的灵活性和实用性，能够在野外环境下快速进行病原体检测，有助于及时采取针对性的医疗防控措施；使用本发明所述的可视化定量检测平台，使得病原体基因检测变得更加简单、快速和灵活，有望在病原体检测等领域中发挥重大作用。