免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒与流程

本发明涉及免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。本技术基于2022年3月25日向日本提出申请的日本特愿2022-050846号主张优先权，本技术援用其内容。

背景技术：

1、就i型前胶原-n-前肽(下文中也记为“p1np”或“pinp”)而言，是在作为骨基质蛋白质的主要成分的i型胶原蛋白由前体的i型前胶原生成时从n末端侧切断的、分子量约35kda的多肽。已知释放到血液中的pinp作为骨形成标志物而敏锐地反映早期的骨形成。因此，就血中pinp浓度而言，对由pth(副甲状腺激素(parathyroid hormone))制剂和双膦酸酯类药剂等骨质疏松症治疗药产生的治疗效果的判定和监测是有用的。pinp(总pinp(totalpinp))的测定中，不仅对作为三聚体的完整pinp(intact pinp)进行检测，也对单体进行检测。

2、作为i型前胶原-n-前肽试剂盒(通常名称)，例如，市售有前胶原完整pinp(产品名，fujirebio公司制，非专利文献1)和elecsys(注册商标)试剂总p1np(total p1np)(产品名，roche diagnostics公司制，非专利文献2)。

3、专利文献1中，公开了用于确定个体的前胶原类型i的氨基末端前肽的存在的方法和试验试剂盒。

4、专利文献2中，公开了i型前胶原的完整的三聚体的α1-同源三聚体形氨基末端前肽或i型前胶原的完整的古典型的异源三聚体形氨基末端前肽的试验法和适用于所述试验法的试验试剂盒。

5、非专利文献3中，公开了三聚体pinp和单体pinp的清除途径(clearance pathway)不同(三聚体：肝脏、单体：肾脏)，肾病患者不能进行单体的清除，存在血中的单体浓度较高的倾向。

6、非专利文献4中，单体pinp反映了pn-胶原蛋白的分解物而不是完整的前肽的热变性物。

7、现有技术文献

8、专利文献

9、专利文献1：日本特表平7-504896号公报

10、专利文献2：日本特开平8-291197号公报

11、非专利文献

12、非专利文献1：fujirebio株式会社，“i型前胶原-n-前肽试剂盒前胶原完整pinp”包装说明书(第13版)，2020年2月

13、非专利文献2：roche·diagnostics株式会社，“i型前胶原-n-前肽试剂盒elecsys试剂(r)总p1np”包装说明书(第9版)，2021年3月

14、非专利文献3：koivula，m.-k.,etc,“measurement of aminoterminalpropeptide of type i procollagen(pinp)in serum”,clinical biochemistry,2012年8月，第45卷，第12号，p.920-927

15、非专利文献4：koivula，m.-k.etc,“difference between total and intactassays for n-terminal propeptide of type i procollagen reflects degradationof pn-collagen rather than denaturation of intact propeptide”,annals ofclinical biochemistry，2010年1月，第47卷，第1号，p.67-71

技术实现思路

1、发明所解决的技术问题

2、非专利文献1所述的前胶原完整pinp(下文中简称为“完整pinp”。)仅能检测i型胶原n端前肽的α链的三聚体。完整pinp是基于放射免疫测定法的测定试剂盒，使用用放射性同位体(125i)进行了标记的抗体。因此，所述试剂盒需要在放射线管理区域进行测定，作为测定时间需要约3小时等，是复杂的。此外，放射性同位体(125i)的半衰期较短，为59.4天，因此试剂盒的有效期间也在2～8℃下缩短至6周。

3、非专利文献2所述的elecsys试剂总p1np(下文中简称为“总p1np”)能够检测i型胶原n端前肽的α链的三聚体和单体。总p1np是基于电化学免疫测定法(eclia，electrochemiluminescence immunoassay)的测定试剂盒，不需要放射线管理区域，测定时间约20分钟等，操作简便，因此已普及。此外，试剂盒的有效期间也在2～8℃下延长至约18个月。

4、认为完整pinp和总p1np的相关性良好，没有较大的性能的差异。

5、然而，在肾病患者中，不能进行i型胶原n端前肽的α链的单体的清除，因此就总p1np而言，来源于肾病患者的样本的pinp值测定得较高。

6、本发明是鉴于上述情况而得到的，其目的之一是提供操作简便并且可以特异性地(选择性地)对包含pinp的α链的三聚体和单体的生物体样品中的三聚体进行测定的、免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。

7、解决问题的技术手段

8、[1]一种生物体样品中的三聚体i型胶原n端前肽的免疫学检测方法，其使用：

9、第1抗体，其与所述三聚体i型胶原n端前肽中的pro-α1链的第1特定部分结合；和

10、第2抗体，其与所述三聚体i型胶原n端前肽中的pro-α1链的第2特定部分结合。

11、[2]根据[1]所述的免疫学检测方法，其中，

12、所述第1抗体和所述第2抗体的至少一者通过标记物质进行了标记，

13、所述免疫学检测方法具备：

14、使生物体样品和所述第1抗体接触，形成第1复合体的工序；

15、使所述第1复合体和所述第2抗体接触，形成第2复合体的工序；和

16、检测来源于所述标记物质的信号的工序。

17、[3]根据[1]所述的免疫学检测方法，其中，

18、所述第1抗体和所述第2抗体的至少一者通过标记物质进行了标记，

19、所述免疫学检测方法具备：

20、使生物体样品和所述第2抗体接触，形成第1复合体的工序；

21、使所述第1复合体和所述第1抗体接触，形成第2复合体的工序；和

22、检测来源于所述标记物质的信号的工序。

23、[4]根据[1]～[3]中任一项所述的免疫学检测方法，其中，

24、所述三聚体i型胶原n端前肽中的pro-α1链的第1特定部分的一级结构包含seq idno.1表示的序列，

25、所述三聚体i型胶原n端前肽中的pro-α1链的第2特定部分的一级结构包含seq idno.2表示的序列，

26、seq id no.1：qeegqvegqd，

27、seq id no.2：pdgsesptdqett。

28、[5]根据[1]～[4]中任一项所述的免疫学检测方法，其中，

29、所述第1抗体和所述第2抗体的至少一者为单克隆抗体。

30、[6]根据[2]或[3]所述的免疫学检测方法，其中，

31、所述生物体样品为选自血液、血浆和血清中的至少1种。

32、[7]根据[1]～[6]中任一项所述的免疫学检测方法，其中，

33、所述免疫学检测方法为选自电化学发光法、乳胶凝集免疫比浊法和酶联免疫吸附试验(elisa)法中的任一种。

34、[8]根据[2]、[3]和[6]中任一项所述的免疫学检测方法，其中，

35、所述生物体样品是来源于egfr值低于30ml/min/1.73m2的对象的样品。

36、[9]根据[1]～[8]中任一项所述的免疫学检测方法，其中，

37、不检测来源于肾病患者的i型胶原n端前肽的单体。

38、[10]一种生物体样品中的三聚体i型胶原n端前肽的免疫学检测试剂盒，其包含：

39、第1抗体，其与所述三聚体i型胶原n端前肽中的pro-α1链的第1特定部分结合；和

40、第2抗体，其与所述三聚体i型胶原n端前肽中的pro-α1链的第2特定部分结合。

41、[11]根据[10]所述的免疫学检测试剂盒，其中，

42、所述第1抗体和所述第2抗体的至少一者通过标记物质进行了标记，

43、使生物体样品和所述第1抗体接触，形成第1复合体，

44、使所述第1复合体和所述第2抗体接触，形成第2复合体，

45、检测来源于所述标记物质的信号。

46、[12]根据[10]所述的免疫学检测试剂盒，其中，

47、所述第1抗体和所述第2抗体的至少一者通过标记物质进行了标记，

48、使生物体样品和所述第2抗体接触，形成第1复合体，

49、使所述第1复合体和所述第1抗体接触，形成第2复合体，

50、检测来源于所述标记物质的信号。

51、[13]根据[10]～[12]中任一项所述的免疫学检测试剂盒，其中，

52、所述三聚体i型胶原n端前肽中的pro-α1链的第1特定部分的一级结构包含seq idno.1表示的序列，

53、所述三聚体i型胶原n端前肽中的pro-α1链的第2特定部分的一级结构包含seq idno.2表示的序列，

54、seq id no.1：qeegqvegqd，

55、seq id no.2：pdgsesptdqett。

56、[14]根据[10]～[13]中任一项所述的免疫学检测试剂盒，其中，

57、所述第1抗体和所述第2抗体的至少一者为单克隆抗体。

58、[15]根据[11]或[12]所述的免疫学检测试剂盒，其中，

59、所述生物体样品为选自血液、血浆和血清中的至少1种。

60、[16]根据[10]～[15]中任一项所述的免疫学检测试剂盒，其使用选自电化学发光法、乳胶凝集免疫比浊法和酶联免疫吸附试验(elisa)法中的任一种的免疫学检测方法。

61、[17]根据[11]、[12]和[15]中任一项所述的免疫学检测试剂盒，其中，

62、所述生物体样品是来源于egfr值低于30ml/min/1.73m2的对象的样品。

63、[18]根据[10]～[17]中任一项所述的免疫学检测试剂盒，其不检测来源于肾病患者的i型胶原n端前肽的单体。

64、发明的效果

65、根据本发明，提供操作简便并且可以特异性地(选择性地)对包含pinp的α链的三聚体和单体的样本中的三聚体进行测定的、免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。