一种脑心清片药效物质基础的改良分析方法与流程

：本发明涉及一种脑心清片药效物质基础的改良分析方法。

背景技术

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背景技术：

1、脑心清片收载于《中国药典》2020年版一部，由柿叶提取物、淀粉等辅料组成，具有活血化瘀，通络的功效，用于脉络瘀阻，眩晕头痛，肢体麻木，胸痹心痛等症，临床上主要适用于心脑缺血性疾病，特别是对脑动脉硬化、脑卒中及其后遗症的疗效显著。脑心清片临床疗效确切，但是其化学成分和作用靶点复杂，其药效物质基础与作用机制仍不明确，目前对脑心清片的药效物质基础研究未见报道。因此分析脑心清药效物质基础、明确其治疗心脑缺血性疾病及相关后遗症的活性成分及其关联的作用靶点和作用通路，同时识别关键质量标志物，对揭示脑心清片的作用机制和提升产品质量具有重要意义。

2、液质联用在中药复方物质组辨识中发挥着重要的作用，超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(uplc-q/tof-ms)技术具有高效率、高灵敏度、高分辨率的特点，同时还能得到化合物的分子量、元素组成以及离子碎片等信息，可快速确定化合物的结构。中药复方制剂口服后，其有效物质首先吸收入血，再通过血液运输到达疾病治疗靶点发挥治疗作用，因此，只有被吸收入血的化学成分或相关代谢物，才有机会在靶器官维持一定的浓度，才有可能被看作是潜在的生物活性成分。运用uplc-q/tof-ms技术，采用血清药物化学方法，可对口服给药后血浆中的吸收原型成分及其代谢产物进行辨识研究，从而明确吸收入血成分，以便准确筛选出生物活性成分。目前，关于uplc-q/tof-ms技术应用于脑心清化学成分和入血成分的分析研究，尚未见报道。

3、现有技术中，脑心清制剂或柿叶提取物中黄酮类成分的研究较多，主要应用hplc技术进行定量分析，另有文献报道原儿茶酸、糠酸等有机酸类成分和齐墩果酸、熊果酸等三萜类成分的含量测定研究。有关该药的化学组成研究报道也多局限于单一或几个指标的含量测定，致使其质量标准控制指标较单一，因此，全面的分析脑心清片的化学成分并确定脑心清片的潜在的生物活性成分作为质量标志物显得尤为重要。

4、网络药理学是在系统生物学与计算机技术高速发展的基础上发展起来的，基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络，系统综合地观察药物对疾病网络的干预与影响，这与中医学从整体的角度去诊治疾病的理论和中药多成分、多靶点、多作用体系的特点相契合。目前，关于网络药理学技术应用于脑心清治疗心脑缺血作用机制的研究尚未见报道。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的目的是提供一种脑心清片药效物质基础的改良分析方法。

2、本发明是通过以下技术方案予以实现的：

3、一种脑心清片药效物质基础的改良分析方法，该方法包括以下步骤：

4、s1.脑心清片化学物质组表征和辨识：利用超高压液相色谱飞行时间质谱(uplc-q/tof-ms)技术对脑心清片中的主要化学成分进行了系统辨识，通过对照品和文献数据比对，分析其质谱裂解规律，从脑心清片中鉴定得到化学成分；

5、s2.脑心清片入血成分及其代谢产物表征和辨识:采用血清药物化学方法，运用超高压液相色谱飞行时间质谱(uplc-q/tof-ms)技术，对口服给予脑心清片后大鼠血浆中的吸收原型成分及其代谢产物进行辨识研究，通过建立给药血浆的血行指纹谱，比对脑心清片制剂、大鼠给药血浆及空白血浆样品的色谱图，筛选分析血中移行的原型药物成分及代谢物，在大鼠血浆中共鉴定得到脑心清片相关的外源性化合物，包括入血吸收原型药物成分和代谢产物；s3.基于网络药理学的脑心清片药效物质基础筛选研究：选取了步骤s2得到的入血吸收原型药物成分为研究对象，基于网络药理学对脑心清片药效物质基础和作用机制进行研究，构建脑心清片的“药效化学成分-蛋白靶点-通路-药理作用-功效”的关联网络，预测脑心清片的可能活性物质和作用机制；

6、s4.基于gpcr受体及酶活性检测的药效物质筛选研究，从分子水平进一步阐明和确定脑心清片的主要药效物质基础，从而确定其质量标志物。

7、步骤s1和s2中色谱条件为：采用uplc液相色谱系统，色谱柱为c18柱，流动相a为(0.07-0.2)％甲酸水，优选为0.1％甲酸水，流动相b为(0.07-0.2)％甲酸乙腈，优选为0.1％甲酸乙腈，流速0.3-0.5ml/min，柱温35-55℃，进样量5μl；梯度洗脱：0～4min，88％～82％a；4～10min，82％～82％a；10～12min，82％～70％a；12～17min，70％～40％a；17～20min，40％～20％a；20～23min，20％～5％a；23～24min，5％～5％a；质谱条件为：采用q-tof高分辨质谱，配备电喷雾离子源esi，毛细管电压正离子模式3.0kv，负离子模式2kv，离子源温度110℃，样品锥孔电压30v，锥孔气流速50l/h，氮气脱气温度350℃，脱气流速800l/h，扫描范围m/z50-2000，内参校准液亮氨酸脑啡肽用于分子量实时校正。

8、优选地，色谱柱的规格为2.1×100mm，1.7μm。

9、对脑心清片的化学成分进行定性分析时，供试品溶液的制备包括以下步骤：取脑心清片1.0g，精密称定，加入70wt％甲醇20ml，称重，超声提取30min，放冷，用70wt％甲醇溶液补足失重，过0.22μm微孔滤膜，续滤液采用uplc-q/tof-ms检测分析。

10、对脑心清片的入血成分进行定性分析时，供试品溶液的制备包括以下步骤：

11、1)脑心清片粉末中加入0.5％的羧甲基纤维素钠溶解混匀制成浓度为1g/ml的混悬液，作为大鼠灌胃溶液；

12、2)动物实验

13、取体重为180-220g雄性sd大鼠12只，置于室温25℃、湿度50％，12h昼夜交替，自由采食、饮水饲养适应一周，实验前禁食不禁水12h，大鼠分为空白组、给药0.5h组、1h、2h、4h、8h组，共6组大鼠，每组2只并称定体重，按10ml/kg的灌胃剂量，空白组给予0.5％的羧甲基纤维素钠溶液，给药组给予步骤1)制备的脑心清片混悬液；

14、实验大鼠给药0.5h、1h、2h、4h和8h后以3％戊巴比妥钠麻醉，肝门静脉取血置肝素化试管中，于4℃条件下3500rpm离心10min分离血浆，置-20℃冰箱中保存备用；

15、3)样品处理

16、将步骤2)得到的给药各时间段大鼠血浆按体积比为1:1混合得到混合血浆，取空白和混合血浆样品各500μl置于ep管中，加入甲醇，涡旋1min混匀，于4℃条件下离心10min沉淀蛋白，上清液n2吹干，残渣以200μl70wt％甲醇涡旋1min复溶，经0.22μm微孔滤膜滤过，续滤液供uplc-q/tof-ms检测分析。

17、制备对照品溶液包括以下步骤：分别称取对照品原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素、齐墩果酸适量，加甲醇制成浓度为100μg/mg的混合对照品溶液。

18、特别地，采用超高压液相色谱飞行时间质谱(uplc-q/tof-ms)技术对脑心清片的化学成分进行定性分析时，使用masslynxtm4.1软件进行数据分析，结合色谱和质谱信息及相关文献，鉴定或表征了40个化合物，包括18个黄酮类、9个三萜类、9个有机酸类、2个香豆素类和2个其他类成分，主要为黄酮类、三萜类、有机酸类等成分。

19、特别地，步骤s2中，通过matabolynxtm软件中的质量亏损过滤技术(mdf)，有效地在复杂的生物基质中搜索和筛选代谢产物，通过筛选仅在给药血浆样品中出现的离子信号，最终在血浆中共鉴定得到30个代谢产物。

20、步骤s2吸收原型药物成分为13个，分别为槲皮素、山柰酚、异鼠李素、原儿茶酸、原儿茶醛、水杨酸、马尾柴酸、齐墩果酸、莨菪亭、19α,24-双羟基乌苏烷酸、白桦脂酸、亚麻酸、亚油酸，代谢产物为30个。

21、步骤s3具体步骤为：借助swiss target prediction服务器、tcmsp等数据库获取脑心清片中13个入血吸收原型药物成分化合物的作用靶点；运用omicsbean软件对靶点蛋白进行生物信息学分析，通过string 10数据库得到与靶点相关的通路过程，利用kegg数据库及相关文献，对得到的通路进行分析；利用string 10数据库中，获得蛋白间相互作用关系，得到结果导入cytoscape软件中，通过cytoscape软件绘制蛋白互作网络，筛选ppi网络中关键靶点蛋白；根据上述靶点及通路预测结果，建立化合物-靶点、靶点-通路、通路-药理作用及药理作用-功效的相互对应关系，然后导入cytoscape软件中构建网络，并运用其插件network analyzer计算网络的特征，得到13个成分的相关靶点、通路预测图，以该图来表示脑心清片“化合物-靶点-作用通路-药理作用-功效”之间的相互关系。

22、步骤s4受体和酶包括：与活血化瘀相关的凝血酶(thrombin)、凝血因子x(factorxa)、血栓素a2受体(tp/tbxa2r)，与抗炎相关的环氧酶-2(cox-2)、5-脂氧合酶(5-lox)、核转录因子κb(nf-κb)，与心脑保护相关的单胺氧化酶a(mao-a)、5-羟色胺受体(5-ht2ar)，所评价的脑心清单体成分，即质量标志物，包括原儿茶酸、原儿茶醛、水杨酸、槲皮素、山柰酚、异鼠李素、白桦脂酸、齐墩果酸、莨菪亭。

23、本发明的有益效果如下：

24、1)首次将uplc-q/tof-ms技术应用到脑心清片化学成分和入血成分鉴定和分析研究中，该方法检测灵敏度高，稳定性好，能够客观、全面、准确地辨识和评价脑心清片体内外药效物质基础成分，不仅可以同时鉴别脑心清片中40种不同结构和类型的药效成分，包括18个黄酮类、9个三萜类、9个有机酸类、2个香豆素类和2个其他类成分，对脑心清片中的主要化学成分进行了系统辨识；还可以对脑心清的入血成分进行鉴定和分析，通过比对脑心清片制剂、大鼠给药血浆及空白血浆样品的色谱图，筛选分析血中移行的原型药物成分及代谢物，得到13个入血吸收原型药物成分和30个代谢产物，13个入血吸收原型药物成分为槲皮素、山柰酚、异鼠李素、原儿茶酸、原儿茶醛、水杨酸、马尾柴酸、齐墩果酸、莨菪亭、19α,24-双羟基乌苏烷酸、白桦脂酸、亚麻酸、亚油酸，从而明确了脑心清片的体外化学成分组-体内血行成分组的药效物质基础传递-转化过程，为脑心清片的质量标志物确定与全面质量控制提供依据，也为其深入分子作用机制研究奠定基础。

25、2)本发明针对脑心清片多成分多靶点的特点，将超高效液相色谱-质谱联用技术与网络药理平台结合，发现了脑心清片药效物质成分及作用机制，揭示了脑心清片复杂的药效网络机制。

26、3)本发明还提供了进一步基于gpcr受体及酶活性检测，从分子水平阐明和确定槲皮素、山柰酚、异鼠李素、白桦脂酸、齐墩果酸、莨菪亭等可能为脑心清片发挥活血化瘀作用的药效物质基础。

27、总之，本发明将uplc-q/tof-ms技术应用到脑心清片化学成分和入血成分鉴定和分析研究中，然后通过标准品参照和文献检索，比对脑心清片、大鼠给药血浆及空白血浆样品的色谱图，筛选分析血中移行的原型药物成分及代谢物，得到13个入血吸收原型药物成分和30个代谢产物，从而明确脑心清片中所含的潜在的生物活性成分作为质量标志物，进一步结合网络药理平台首次阐明了脑心清片的药效物质基础和作用机制，更进一步基于gpcr受体及酶活性检测，从分子水平进一步阐明和确定槲皮素、山柰酚、异鼠李素、白桦脂酸、齐墩果酸、莨菪亭可能为脑心清片发挥活血化瘀作用的药效物质基础，为建立更科学、高效的脑心清质量控制体系奠定了基础。本方法也为其他中药复方关键药材质量标志物的识别提供了新参考，对中药复方的质量控制研究具有重大意义。