一种基于超速离心法测定蛋白降解靶向嵌合体药物血浆蛋白结合率的方法与流程

本发明属于生物医药分析，具体涉及一种基于超速离心法测定蛋白降解靶向嵌合体药物血浆蛋白结合率的方法。

背景技术：

1、蛋白靶向降解是药物研发领域的一个新兴方向。蛋白靶向降解药物致力于将小分子设计成为一种新型药物。传统小分子具有阻断蛋白的作用，而蛋白靶向降解剂是通过将蛋白送入蛋白酶体将它们完全降解。蛋白降解靶向嵌合体(proteolysis-targetingchimera，protac)最大的优势之一是能够使靶点从“无成药性”变成“有成药性”。传统小分子抑制剂需要与靶蛋白具有很强的结合，通常是与活性位点结合。然而人类细胞中80％的蛋白缺乏这样的位点。由于protac只需要与目标蛋白弱结合就可以特异性地“标记”它，因此，目前蛋白质组中大约～80％不可成药的蛋白具有能够利用protac技术的可能性。目前蛋白降解靶向嵌合体已经在生物医药科学界和工业界受到极大关注。

2、protac分子主要由三部分组成，包括靶蛋白配体、连接子和e3泛素连接酶配体。protac分子通过其一端的靶蛋白配体特异性地识别并结合靶蛋白，通过其另一端的e3泛素连接酶配体特异性地识别并结合e3泛素连接酶。protac分子通过给靶蛋白添加泛素化标签，巧妙利用泛素-蛋白酶体系统降解有缺损或受损蛋白，以期实现在肿瘤、炎症、免疫学及神经退行性疾病等领域的治疗突破。

3、药物的分布、代谢、排泄以及与相应受体结合继而发生药理效应，这些通常以游离形式进行，因此可认为游离药物才是血液乃至靶点的“活性药物”形式。血浆蛋白结合(plasma protein binding，ppb)是了解药物分布、清除、药代动力学和药效学最重要的决定因素之一。药物血浆蛋白结合率，即血液中与蛋白结合的药物占总药量的百分数，可以反映药物与血浆蛋白结合的程度。药物进入循环系统后，因结构上的差异或多或少会与血液中的成分形成结合型药物，而未被结合的部分则称为游离型药物。药物的结合主要通过离子键、氢键、疏水性结合及范德华力结合，一般是可逆的。结合型药物分子变大不易透膜而“储存”于血液中，经血液运输通过游离药物分布到机体各组织部位。因病理等原因，药物与血浆蛋白结合的变化可能导致药物消除速率常数的改变，从而对体内血浆浓度产生暂时或持续的影响。因此对于治疗窗口窄、游离分数低、清除率高或分布容积小的药物，其血浆结合率在体内发生变化时可能具有潜在的临床价值，对于创新药物候选化合物的早期筛选具有重要指导意义。

4、目前常用于血浆蛋白结合率测定的方法主要包括平衡透析法、超滤法和超速离心法等。结果通常表示为未结合游离分数(fu,％fraction unbound)或蛋白结合率(pb，％protein binding)。只有当体系达到真正的平衡、化合物在生物基质中没有发生代谢或降解，且缓冲液中游离样品的浓度满足分析灵敏度的要求时，平衡透析法测试得到的fu才是可靠的。对于protac类化合物，往往需要很长的时间达到平衡，甚至在有些情形下达不到平衡，包括血浆稳定性、非特异性吸附等问题，导致fu难以被准确测定。超滤法与平衡透析法类似。同样采用半透膜分隔的两隔室装置进行测定。含药蛋白溶液加入上层隔室，在外界压力或者离心条件快速的使游离药物运动至下方缓冲溶液侧，通过测定两侧化合物浓度计算蛋白结合率。总体来说，平衡透析法和的超滤法主要缺点之一是药物吸附在膜上，这限制了它们在亲脂性化合物protac药物中的应用。

5、另外，针对protac这类新兴的创新药物，血浆蛋白的结合率不仅关系到药效和安全性，更关系到化合物自身的pk性质。因此，protac生物分析面临诸多挑战，其中之一为相对分子质量较大。如前所述，protac分子具有3个基本结构特征，即靶蛋白配体、e3连接酶配体和连接配体的连接子，其相对分子质量约为650da到1000da，超过了类药五规则相对分子质量通常<500da的限制。因此，protac相对分子质量大，可能会使油水分系数(logp)、氢键供体(hbd)、氢键受体(hba)、可旋转键和极性表面积更难实现为理想状态，使得溶解性和渗透性变差，在质谱中易出现多电荷离子，带来灵敏度的降低。同时，血浆蛋白结合通常与亲脂性相关，具备高亲脂性的protac预计具有低的未结合血浆蛋白分数。如何准确测定高亲脂性protac的fu存在挑战。

技术实现思路

1、影响血浆蛋白结合率测定的因素很多，如溶解度、温度、非特异性结合、酯酶代谢等，需要根据化合物特征开发合适的测定方法。尤其是若药物具有很高的蛋白结合能力，测试方法不当可能会使测试结果出现较大偏差，从而大大提高血液中药物的暴露量浓度而引起安全性问题。也就是说，不准确的fu值可能导致对候选药物重要属性的误解。因此有必要建立一种快速且准确检测protac药物在不同种属中血浆蛋白结合率的方法，用于预测药物-药物相互作用潜力和表征重要候选药物性质。

2、本发明建立一种基于超速离心法测定蛋白降解靶向嵌合体药物血浆蛋白结合率的方法，通过比较无蛋白上清液和完整的药物的浓度来计算游离分数，避免了膜相关等问题，例如跨膜渗漏、体积移位、非特异性结合等，而且能够快速且准确地检测蛋白降解靶向嵌合体药物在不同种属中血浆蛋白结合率。

3、为了解决上述问题，本发明提供一种检测蛋白降解靶向嵌合体药物血浆蛋白结合率的方法。通过控制含蛋白降解靶向嵌合体药物的血浆样品的超速离心参数，使蛋白降解靶向嵌合体药物分布在离心后样品的中间层且不与蛋白类物质和蛋白降解靶向嵌合体药物-蛋白复合体分布在离心后样品的相同层；然后以该中间层的药物浓度与未经过离心的血浆样品的药物浓度的比值作为评估蛋白降解靶向嵌合体药物血浆蛋白结合率的游离率。

4、较佳地，所述制备方法包括以下步骤：

5、步骤(1)配制含蛋白降解靶向嵌合体药物的血浆样品：将空白血浆、蛋白降解靶向嵌合体药物和有机溶剂混合均匀，得到蛋白降解靶向嵌合体药物的浓度为0.1～50μmol/l的血浆样品；

6、步骤(2)预孵育：将含蛋白降解靶向嵌合体药物的血浆样品在4～37℃预孵育10～60分钟；步骤(3)超速离心：移取预孵育后的含蛋白降解靶向嵌合体药物的血浆样品，加入到超速离心管，于4～37℃在离心力470000g-1000000g下离心0.5小时以上；离心后的血浆样品具有上层、中间层和下层，分离出中间层作为f样品；

7、步骤(4)配制ts样品：移取预孵育后的含蛋白降解靶向嵌合体药物的血浆样品，在4～37℃再孵育0.5～2小时得到ts样品；

8、步骤(5)lc-ms/ms分析：分别移取f样品和ts样品到对应的样品接收板上，在f样品对应的样品接收板中补充空白血浆，在ts样品对应的样品接收板中补充pbs缓冲液；随后在所有的样品接收板中加入终止液，震荡均匀，离心取上清液并进行lc-ms/ms分析以测定样品的药物浓度；

9、步骤(6)：根据f样品的药物浓度与ts样品的药物浓度的比值作为评估蛋白降解靶向嵌合体药物血浆蛋白结合率的游离率。

10、较佳地，步骤(5)中，f样品、空白血浆与终止液的的体积比为1:1：(3～10)；ts样品、pbs缓冲液与终止液的体积比为1:1：(3～10)。

11、第二方面，本发明提供一种评估蛋白降解靶向嵌合体药物在血浆中的稳定性的方法，包括以下步骤：

12、步骤(1)配制含蛋白降解靶向嵌合体药物的血浆样品：将空白血浆、蛋白降解靶向嵌合体药物和有机溶剂混合均匀，得到蛋白降解靶向嵌合体药物的浓度为0.1～50μmol/l的血浆样品；

13、步骤(2)：配置t0样品：移取含蛋白降解靶向嵌合体药物的血浆样品到样品接收板中，依次加入pbs缓冲液和终止液，混合均匀，得到t0样品；

14、步骤(3)预孵育：移取含蛋白降解靶向嵌合体药物的血浆样品在4～37℃预孵育10～60分钟；

15、步骤(4)配制ts样品：移取预孵育后的含蛋白降解靶向嵌合体药物的血浆样品，在4～37℃再孵育0.5～2小时得到ts样品；

16、步骤(5)lc-ms/ms分析：分别移取t0样品和ts样品到对应的样品接收板中，在所有的样品接收板中补充pbs缓冲液；随后加入终止液，震荡均匀，离心取上清液并进行lc-ms/ms分析以测定样品的药物浓度；

17、步骤(6)：根据ts样品的药物浓度与t0样品的药物浓度的比值确定蛋白降解靶向嵌合体药物在血浆中的稳定性。

18、较佳地，步骤(2)中，含蛋白降解靶向嵌合体药物的血浆样品、pbs缓冲液和终止液的体积比为1：1：(3～10)。

19、较佳地，步骤(5)中，t0样品、pbs缓冲液与终止液的体积比为1：1：(3～10)；ts样品、pbs缓冲液与终止液的体积比为1：1：(3～10)。

20、第三方面，本发明提供一种评估蛋白降解靶向嵌合体药物在超速离心条件下的回收率的方法，包括以下步骤：

21、步骤(1)配制含蛋白降解靶向嵌合体药物的血浆样品：将空白血浆、蛋白降解靶向嵌合体药物和有机溶剂混合均匀，得到蛋白降解靶向嵌合体药物的浓度为0.1～50μmol/l的血浆样品；

22、步骤(2)配制t0样品：移取含蛋白降解靶向嵌合体药物的血浆样品到样品接收板中，依次加入pbs缓冲液和终止液，混合均匀，得到t0样品；

23、步骤(3)预孵育：移取含蛋白降解靶向嵌合体药物的血浆样品在4～37℃预孵育10～60分钟；

24、步骤(4)超速离心：移取预孵育后的含蛋白降解靶向嵌合体药物的血浆样品，加入到超速离心管，于4～37℃在离心力470000g-1000000g下离心0.5小时以上；离心后的血浆样品具有上层、中间层和下层，分离出中间层作为f样品，混合上层和下层作为r样品；

25、步骤(5)lc-ms/ms分析：分别移取f样品、r样品和t0样品到对应的样品接收板中，在f样品对应的样品接收板中补充空白血浆，在r样品和t0样品对应的样品接收板中分别补充pbs缓冲液；随后在所有的样品接收板中加入终止液，震荡均匀，离心取上清液并进行lc-ms/ms分析以测定样品的药物浓度；

26、步骤(6)根据以下公式计算回收率：回收率＝(cr×(v1-v2)+cf×v2)/(ct0×v1)，其中，v1为用于超速离心的预孵育后的含蛋白降解靶向嵌合体药物的血浆样品的体积，v2为f样品的体积，cr为r样品的药物浓度，cf为f样品的药物浓度，ct0为t0样品的药物浓度。

27、较佳地，步骤(2)中，含蛋白降解靶向嵌合体药物的血浆样品、pbs缓冲液和终止液的体积比为1：1：(3～10)。

28、较佳地，步骤(5)中，f样品、空白血浆与终止液的体积比为1：1：(3～10)；r样品、pbs缓冲液与终止液的体积比为1：1：(3～10)；t0样品、pbs缓冲液与终止液的体积比为1：1：(3～10)。