一种基于金铂壳及金-钴多面体复合材料电化学传感器的制备方法

本发明涉及食品安全检测，具体涉及一种基于金铂壳及金-钴多面体复合材料电化学传感器的制备方法。

背景技术：

1、玉米、小麦、大米营养丰富，是人们日常饮食中必不可少的食物。我国粮食受真菌毒素污染严重，据估算每年受真菌毒素污染约3500万吨，约占总产5%。在全球每年约有1.25亿吨玉米、小麦、大米受真菌毒素污染。目前真菌毒素有400多种，在众多真菌毒素中，黄曲霉毒素b1 (aflatoxin b1，afb1)是毒性最高的致癌物之一，已被国际癌症研究机构(iarc)归为ⅰ类致癌物。除了致癌之外，afb1还会导致抑郁、紧张、疼痛、腹泻、肝毒性、癌症、甚至死亡。基于此，不同的国家制定了不同的afb1限量允许水平。例如，欧盟委员会规定了所有谷物食品中的afb1的限定值为2 µg/kg，世界卫生组织(who)规定花生和玉米饲料中afb1污染水平为5 µg/kg，美国食品和药物管理局规定花生和玉米饲料中最高中的afb1污染水平为3µg/kg，我国规定玉米、花生、大米等食品中afb1的含量不能超过20 μg/kg。因此，为了满足现行法规同时保护消费者权益，有必要开发一种简单、快速、准确、灵敏度高、特异性强的afb1检测方法。

2、目前用于afb1检测的方法主要包括高效液相色谱法(hplc)、液相色谱-质谱联用(lc-ms)、酶联免疫吸附法、荧光分析法等。这些方法具有较高的灵敏性和特异性，但需要复杂的样品前处理程序、需要昂贵的实验设备和经过训练的实验人员，难以满足现场准确检测的要求。此外酶联免疫吸附法具有操作简便、经济廉价且对样品纯化简单等优点。然而，由于酶本身的不稳定性，用此方法检验有可能带来假阳/阴性结果，检测精度还有待提高，并且需要制备特异性抗体，步骤繁琐且时间长。电化学传感器分析时间短、成本低、制作简单、易于微型化等优点受到了广泛的关注。然而，为了进一步提高电化学传感器的灵敏度，本方法设计了金-钴多面体复合材料和金铂壳两种复合纳米材料。金-钴多面体复合材料的使用可以使电化学传感器具有更大的表面积，更好的导电性和催化性。金铂壳复合纳米材料的引用，进一步提高了电极的导电性，并且通过引用金属纳米颗粒增加了材料的比表面积，可以更好的固定dna链。基于本发明的电化学传感具有灵敏度高、选择性好、稳定性优、便捷经济的特点，有利于发明的推广应用。

技术实现思路

1、本发明设计一种基于金铂壳及金-钴多面体复合材料电化学传感器的制备方法。

2、一种基于金铂壳及金-钴多面体复合材料电化学传感器的制备方法，按照以下步骤进行：

3、（1）金属有机框架的制备：将过渡金属硝酸物和有机配体a溶解于有机配体b中，之后，将混合溶液剧烈搅拌。高速离心收集产物，随后用有机配体c冲洗以除去未反应的溶剂，真空干燥至恒重即得金属有机框架。

4、（2）金-钴多面体复合材料的制备：将金属有机框架超声分散在水中，加入贵金属溶液a。混匀后，加入高分子化合物，超声混匀。用磁力搅拌器搅拌，缓慢滴加还原剂，将混合物接着搅拌，高速离心收集产物，随后用超纯水冲洗除去未反应的溶剂，得到金-钴多面体复合材料，分散在超纯水中放在4 ℃下备用。

5、（3）金铂壳复合纳米材料的制备：将贵金属溶液a加热搅拌，溶液沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠。观察到溶液逐渐变成暗红色，保持沸腾，冷却以备后用。取上述制备的溶液和等量的超纯水混合均匀，加热至沸腾，边搅拌边加入贵金属溶液b，滴加还原剂继续加热，溶液由暗红色变成黑色，冷却至室温。高速离心收集产物，随后用超纯水冲洗以除去未反应的溶剂，得到金铂壳复合纳米材料，分散在超纯水中放在4 ℃下备用。

6、（4）金铂壳复合纳米材料表面修饰dna链h2和dna链h3及信号标签：将上述制备的金铂壳复合纳米材料分散在1 ~ 2 μm的dna链h2和dna链h3中，在恒温振荡器上振荡9 ~ 15h，得到金铂壳-dna链h2或者dna链h3的生物偶联物。然后，将信号标签滴入上述混合溶液中，在恒温振荡器上振荡5 ~ 10 h。最后，高速离心收集产物，除去未结合的dna链h2、dna链h3和信号标签，分散到缓冲液中放在4 ℃下备用。

7、（5）mbs@s-dna/apt体系的制备：通过1 ~ 2 μm 适配体链（apt）上的生物素与1 ~10 μl 磁珠（mbs）表面包被的链霉亲和素之间的强结合作用将apt负载在mbs上，然后1 ~ 2μm 互补链（s-dna）与apt碱基互补配对形成双链结构，磁分离并用缓冲液洗涤，去除上清液后即成功构建mbs@s-dna/apt体系。

8、（6）电化学传感器的构建及目标物的识别：将2 ~ 8 μl金-钴多面体复合材料滴加到预处理的电极表面，在25 ~ 40 ℃环境下孵育0.5 ~ 2.5 h，使材料物理吸附在电极表面。加入2 ~ 8 μl 1 ~ 2 μm dna链h1，其通过金-硫键固定在修饰材料上，当mbs@s-dna/apt体系中存在afb1时，afb1与2 ~ 8 μl 1~2 μm apt结合使s-dna脱落，s-dna打开电极上的dna链h1，加入2 ~ 8 μl dna链h2-信号标签和2 ~ 8 μl dna链h3-信号标签引发杂交链式反应，使得大量的信号探针连接在电极上，最后将电极放入缓冲溶液中，利用方波伏安法检测到信号标签的电化学信号。

9、进一步限定，步骤（1）中，所述的有机配体a、b、c为2-甲基咪唑、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮中的一种或多种；所述的过渡金属硝酸物为硝酸铜、硝酸银、硝酸锌、硝酸钴六水合物中的一种或多种。

10、进一步限定，步骤（2）中，所述的高分子化合物为聚碳酸酯、聚酰亚胺、聚芳酰胺、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。

11、进一步限定，步骤（4）中，所述的信号分子为硫堇、亚甲基蓝、二茂铁、中性红中的一种或多种。

12、进一步限定，步骤（5）中，所述的mbs的体积为1 ~10 μl。

13、进一步限定，步骤（2）（3）中，所述的贵金属溶液a、b为氯铂酸、四氯金酸、氯钯酸钠、硝酸铑中的一种或多种；所述还原剂为硼氢化钠、抗坏血酸、柠檬酸盐、水合肼中的一种或多种。

14、进一步限定，步骤（4）（5）（6）中，所述的dna链的浓度为1 ~2 μm；所用体积为5 ~10μl；孵育时间为0.5 ~ 2.5 h；孵育温度为20 ~ 50 ℃；所述的dna链h1的序列为：5’-gagatt aga gaa cac gtt ggg cac gtg ttc tct ttt ttt-(ch2)6-sh 3’；所述dna链h2的序列：5’ sh-(ch2)6-g tgt tct cta atc tcc tag gta gag aga ttc gct-3’；所述dna链h3的序列：5’-gag att aga gaa cac a gcg aat ctc tct acc tag-(ch2)6-sh 3’；所述适配体链apt的序列：5’-gtt ggg cac gtg ttg tct ctc tgt gtc tcg tgc cct tcg cta ggccca ca-biotin 3’；所述互补链s-dna的序列：5’-cag aaa aaa aga gac aac acg tgc ccaac-3’。

15、一步限定，步骤（1）（2）（3）（4）（5）（6）中，所述的缓冲溶液为tris-hcl缓冲溶液、pbs缓冲溶液、三乙醇胺、hepes溶液、tris-edta中的一种或多种。