一种用于真菌检测的免清洗双色细胞成像荧光素碳点染色液及染色方法和应用

本发明属于荧光素碳点染色液，具体涉及一种用于真菌检测的免清洗双色细胞成像荧光素碳点染色液及染色方法和应用。

背景技术：

1、表皮真菌的检测对于皮肤、毛发的疾病诊断和预防有着重要的指导作用。传统的表皮真菌检测方法主要是真菌涂片镜检和真菌培养。涂片镜检是将所取标本直接置于玻片上，用染色或加10％koh溶液，在光镜下检查，但是真菌与组织细胞之间的反差不大，鉴别真菌非常困难，很大程度需要依赖操作人员的经验来解释结果，有很大的可能性会造成误检。真菌培养是浅部真菌感染判断的金标准，但由于病原菌的复杂性，所耗费的时间较长，在实际的日常工作中难以满足临床要求。

2、近年来，真菌荧光染色法作为传统真菌镜检法改良技术，因其快速灵敏并且特异性高，在临床上得到了越来越广泛的关注，真菌荧光染色法通过使用荧光染料，在荧光显微镜特定的激发光波段照射下，荧光染料靶向的真菌可与黑暗背景形成显著反差，使得真菌在显微镜下形态结构清晰可见，易于观察，大大提高了工作效率和临床真菌检测的灵敏度。目前市面上用于表皮真菌检测中的荧光试剂配方复杂，配制繁琐，性能不稳定。荧光试剂一般包括三种主要成分，荧光增白剂、氢氧化钾和背景复染剂：1)荧光增白剂与组织中β-多糖成分相结合，产生荧光；2)氢氧化钾能溶解样品组织中的角质、消除杂质，并使组织透明；3)背景复染剂能降低样品组织的背景亮度，使荧光信号更加清晰。然而，由于荧光增白剂在强碱环境中稳定性差，荧光素会发生析出沉淀现象；而且背景复染剂也会影响荧光增白剂的稳定性，会引起检测灵敏度的降低；且染色步骤繁琐，无法达到临床对真菌的快速筛查的要求。因此，有必要提供一种不需要联用其他复杂试剂，性能稳定的真菌检测方法，以解决现有技术中的不足。

3、碳点是指至少某一维度的尺寸大小在10nm范围内的零维碳基纳米颗粒，近几年由于其优越生物相容性和光致发光性等特性，被广泛应用于化学传感、药物递送、光催化剂和食品检测等领域而备受关注。生物成像也是其应用最广泛的一个领域，经实验验证通过在碳核表面修饰多种亲和基团来靶向微生物的策略能有效满足临床对微生物的快速筛查的要求。

4、现有技术之一中的荧光染色剂，涉及检测真菌和皮肤寄生虫，成分复杂，由水、荧光增白剂、氢氧化钾、背景复染剂、促溶剂和保湿剂组成。

5、其存在以下缺点：1)成分复杂，一般需要加入背景复染剂来降低样品组织的背景亮度，需要碱溶解样品组织中的角质、消除杂质，从而使荧光信号更加清晰，但是这些溶剂会影响荧光增白剂的稳定性，导致性能不稳定，又需要其他试剂维持稳定，导致溶液配制繁琐；2)染色后，真菌在荧光显微镜下呈蓝色荧光，伤眼；3)荧光增白剂、碱等的生物相容性较差，有一定的生物毒性。

6、现有技术之二的荧光染色液，成分包括包括入麦胚素、异硫氰酸荧光素、碘化丙啶、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、丙三醇、proclin 300和水，作用为能结合形态学实现对阴道分泌物样本、宫颈脱落细胞样本、皮肤样本以及痰液样本中微生物的检测。

7、其存在以下缺点：1)该染色液是利用凝集素对糖蛋白的特异性识别和核酸染料对核酸的特异性染色，成本高；2)成分复杂，配制繁琐，荧光素性能不稳定；3)对制片要求高，步骤繁琐。

8、现有技术之三的荧光染色液同样含有荧光素碳点材料，原料为荧光增白剂33、柠檬酸、乙二胺，其存在以下缺点：能对实验室培养的真菌进行观察，但未涉及在不能消除杂质如皮屑的影响对真菌的检测，不能满足临床快速筛查的要求。

技术实现思路

1、为了解决目前的荧光染色液成分复杂，性能不稳定，发光单一的问题，本发明的第一个目的在于提供一种用于真菌尤其是表皮真菌检测的免清洗双色细胞成像荧光素碳点染色液，该染色液只含有荧光素碳点和水，成分简单，性能稳定，可以双色成像，且可以使待测样品免清洗，且在荧光显微镜下长时间不猝灭。

2、本发明的目的还在于提供采用上述染色液进行真菌尤其是表皮真菌染色的方法，该方法简单易行，耗时短，且该染色液对菌靶向能力好，能通过形态学明显区分皮屑和菌，成片质量高。

3、本发明的最后一个目的在于提供上述荧光素碳点染色液在采用荧光染色法进行真菌尤其是表皮真菌检测中的应用。

4、本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于真菌检测的双色细胞成像荧光素碳点染色液，以质量百分含量计，包括：荧光素碳点材料0.50％～1.50％、水98.50％～99.50％；其中所述荧光素碳点材料由以下质量百分含量的原料制成：荧光增白剂135#0.5％～1.3％、乙二胺25％～29％、过硫酸铵0.05％～0.13％、水69.57％～74.45％。

5、荧光增白剂135#是一种在激发光的照射下发蓝光，微溶于水的荧光素，在镜检时，为了更好的成像，往往搭配强碱用以溶解组织，然而碱的加入会极大影响荧光增白剂的稳定性，导致性能不稳定。因此本技术中先使用荧光增白剂135#、乙二胺、过硫酸铵、水为原料一步水热碳化形成的碳点，其中具有较好还原型的乙二胺帮助碳点成核，过硫酸铵具有的氧化性进一步提高了碳点的光学性能，荧光增白剂135#分子结构更小，更易成核，因而制成了水溶性良好且稳定、发黄光，能强力靶向真菌的荧光素碳点材料。

6、本发明荧光素碳点材料的制备原料有：乙二胺、荧光增白剂135#、过硫酸铵和水。

7、本发明所述荧光素碳点材料优选通过以下方法制备获得：选取荧光增白剂135#、过硫酸铵、乙二胺和水，采用水热法一步反应制备而成，反应产物经过滤得到荧光素碳点材料。

8、优选地，所述荧光素碳点材料采用水热法一步反应制得，包括在温度为120～180℃条件下进行水热反应8～12小时。

9、更佳地，所述荧光素碳点材料采用水热法一步反应制得，包括在温度为140℃的烘箱中进行水热反应10小时。

10、本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：采用上述荧光素碳点染色液进行真菌染色的方法，包括以下步骤：

11、1)制片：取洁净载玻片，在中间区域滴水，并将待测样本移至水滴处，加热烘干，制片完成；

12、2)染色：将荧光素碳点染色液滴加到待测样本上进行覆盖并染色2min～10min，风干；

13、3)封片：取盖玻片直接加盖染色完成的载玻片；

14、4)镜检：取样片载玻片于荧光显微镜下uv光和蓝光波段进行观测，查看待测样本中真菌的形态及荧光强度。

15、优选地，步骤4)中在320～400nm波段的紫外光下进行观测，待测样本在紫外激发下呈现青色荧光，在400～470nm波段的蓝光下进行观测，待测样本在蓝光激发下呈现明亮黄色荧光。

16、更佳地，步骤4)中在365nm波段的紫外光下进行观测，待测样本在紫外激发下呈现青色荧光，在455nm波段的蓝光下进行观测，待测样本在蓝光激发下呈现明亮黄色荧光。

17、本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述荧光素碳点染色液在采用荧光染色法进行真菌尤其是表皮真菌检测中的应用。

18、本发明具有以下优点：

19、(1)本发明中的荧光素碳点材料制备简单，通过水热法可一步制备，本发明配方为单剂型，成分简单，产品稳定性好；

20、(2)本发明中的染色液制片简单，快速，只需一步操作即可完成染色；

21、(3)本技术的荧光染色液不仅能对实验室培养的真菌进行标记，也能在不含强碱和促溶剂情况下立即检测表皮真菌，充分满足了临床上快速筛查的要求，且染色液配方生物毒性小；

22、(4)本发明提供了一种以荧光增白剂135#、乙二胺、过硫酸铵为原料通过水热反应法合成的碳点(carbon dots，cds)，该碳点材料不仅保留了荧光增白剂基团对真菌的高度亲和能力，也改变了荧光增白剂的理化性质，制成的染色液具有长时间在水溶液中保持稳定的能力，荧光素光学性质也发生改变，荧光素碳点的最大激发波长为470nm，最大发射波长为555nm，因此能在荧光显微镜蓝光455n下进行观测，使待测样本在蓝光激发下呈现明亮黄色荧光，但是该碳点在蓝光波段也有较大的发射，因此在荧光显微镜中紫外365nm的光下进行观测，待测样本能在紫外激发下呈现青色荧光，区别于荧光增白剂135常规的蓝色荧光；且所述荧光素碳点染色试剂成分简单，能够对表皮真菌进行快速染色，不需要与其它复杂试剂相结合就能保持样品组织的低背景亮度；

23、(5)本发明通过对配方的升级，通过加入氧化剂过硫酸铵，实现了对真菌的强力亲和，使得表皮真菌在染色后能呈现紧实的球状，有区别于皮屑晕染状的特异的形态学结构，因此能够在不消除皮屑的情况下直接对表皮真菌的感染情况进行判断；采用本发明中的荧光素碳点染色液进行真菌染色的方法，在荧光素碳点材料与含有皮屑等的样品混合后，即可使其中掩藏的真菌菌体标记上荧光，在荧光显微镜下成像，该方法过程简单易行，耗时短，所得碳点荧光稳定，荧光强度高，对表皮真菌的成像效果好；本发明以此为基础，制备所得的荧光素碳点材料具备发展成一种标记表皮真菌的通用荧光染料的潜力；因此，本发明提供了一种能在不消除皮屑的情况下，能准确判断表皮真菌存在的黄色发光荧光素碳点染色试剂，且成分简单，能长期保持稳定，大大降低了成本。