一种检测CHO细胞宿主蛋白残留的专属试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于药物检测分析领域，具体涉及一种检测cho细胞宿主蛋白残留的专属试剂盒及其检测方法。

背景技术：

1、宿主细胞蛋白(hcps)是指生物工程药物中来源于宿主细胞的蛋白成分，宿主细胞蛋白不仅能诱导机体产生抗宿主细胞蛋白的抗体引起免疫反应，而且“佐剂效应”能使机体对蛋白质药物产生抗体，影响药物治疗效果。因此必须使用高灵敏度的elisa检测法进行检测，监控其降低到可接受水平，以确保产品质量和患者的安全。很大程度上elisa检测法检测的灵敏度取决于所用抗宿主细胞蛋白的抗体对宿主细胞蛋白的覆盖率，覆盖率越高灵敏度越高。

2、抗体类药物的临床前及临床早期阶段，hcp检测普遍使用商业化elisa试剂盒，是业内的通常做法。在先前的研究中，本公司已经自主研发了全人源抗pd-1单克隆抗体赛帕利单抗注射液，在该产品商业化阶段前期，本公司对其进行hcp的检测采用的是供应商cygnus的商业化试剂盒。经覆盖率评估，其对本产品中hcp的覆盖率仅为64％，对产品hcp的检测存在局限，即不能对hcp在种类和数量上相对充分地识别进而检测，以更好地控制产品的质量。

3、因此，针对上述情况，需要开发适合本公司全人源抗pd-1单克隆抗体产品赛帕利单抗注射液(研发代码：gls-010)的hcp检测专属试剂盒，以提高专属性抗体的覆盖率、灵敏度，更好的实现对产品质量的控制。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种检测cho细胞宿主蛋白残留的专属试剂盒。

2、本发明还要解决的技术问题是，提供上述专属试剂盒的检测方法。

3、本发明的整体思路为：专属试剂盒的开发是利用cho-k1宿主细胞构建空载体细胞系cho-k1-a4，并使用赛帕利单抗注射液专属的细胞培养工艺进行空载体细胞的培养以生产无本品蛋白的hcp抗原。将获得的hcp抗原用来免疫山羊来生产抗hcp血清。之后，收集的血清通过亲和层析纯化来获得抗hcp抗体。其中部分抗体会与辣根过氧化物酶(hrp)结合，作为检测试剂盒中的检测抗体。最后通过syproruby染色二维凝胶和蛋白免疫印迹(2dwb)来评估该试剂盒中抗体针对本品hcp的覆盖率，结果为82％。该结果表明已开发的针对赛帕利单抗注射液hcp检测专属试剂盒对本品的hcp有着更好的识别能力。

4、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

5、一种检测cho细胞宿主蛋白残留的专属试剂盒，所述的专属试剂盒包括：hcp抗原标准品、抗hcp抗体、辣根过氧化物酶标记的检测抗体识别cho宿主细胞蛋白不同的抗原表位。

6、其中，所述的抗hcp抗体、辣根过氧化物酶标记的检测抗体均由cho宿主细胞蛋白作为免疫原免疫山羊制得。

7、其中，所述的专属试剂盒为针对全人源抗pd-1单克隆抗体产品赛帕利单抗注射液的hcp检测专属试剂盒。具体的，所述的全人源抗pd-1单克隆抗体产品赛帕利单抗注射液，其相应的编码pd-1抗体的轻、重链基因信息已公开在专利cn106432494b9中。

8、其中，所述的cho宿主细胞蛋白为生产全人源抗pd-1单克隆抗体产品赛帕利单抗注射液时所用的cho-k1宿主细胞蛋白。

9、其中，所述的hcp抗原标准品为cho-k1宿主细胞蛋白。

10、其中，所述的抗hcp抗体为捕获抗体，具体为抗cho宿主细胞蛋白抗原的山羊多克隆抗体，用于捕获待测样本中的抗原。

11、其中，所述的辣根过氧化物酶标记的检测抗体为hrp酶标抗体，具体为辣根过氧化物酶标记的抗hcp抗体，用于检测和定量cho宿主细胞蛋白。

12、其中，所述的专属试剂盒还包括显色液、封闭液和终止液；具体的，所述的显色液为tmb(商业化试剂，品牌opteiatm，货号：555214)，所述的封闭液为1％ bsa溶液，溶剂为0.05％的pbst缓冲液，其配制过程为：1g bsa加入到100ml的0.05％pbst缓冲液中，充分混匀；所述的终止液为2mol/l硫酸溶液。

13、上述专属试剂盒基于通过将捕获抗体包被于高吸附96孔板上，抗体特异性地识别样品中的hcp抗原，hrp酶标抗体与hcp结合，形成固相抗体-hcp-酶标抗体复合物，hrp酶催化tmb底物进行显色反应，在450nm和650nm波长下读取吸光度，吸光度与cho-k1宿主细胞蛋白残留量成正比，以此达到定量测定cho-k1宿主细胞蛋白残留量的目的。

14、上述专属试剂盒检测cho细胞宿主蛋白残留的方法也在本发明所保护的范围之内，具体包括如下步骤：

15、(1)用抗hcp抗体包被酶标板；

16、(2)用0.05％ pbst缓冲液洗板；

17、(3)向步骤(2)洗涤后的酶标板中加入封闭液封闭酶标板，完成封闭后，再用0.05％ pbst缓冲液洗板；

18、(4)向步骤(3)制得的酶标板中加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体溶液、hcp抗原标准品以及待测样品溶液，孵育，洗涤；

19、(5)向步骤(4)洗涤后的酶标板中加入显色液显色，避光孵育，加入终止液终止反应，于450nm与650nm波长下测定吸收度值。

20、其中，步骤(1)中，所述的抗hcp抗体先用cbs溶液稀释成浓度为5.0～5.5μg/ml的抗hcp抗体工作液后再用于包被酶标板；具体的，所述的抗hcp抗体工作液，其加入量为100～110μl/每孔。

21、其中，步骤(3)中，所述的封闭液，其加入量为200～220μl/每孔；所述的封闭酶标板，其封闭孵育时间为60min。

22、其中，步骤(4)中，所述的hcp抗原标准品和待测样品溶液，二者的加入量均为50μl/每孔；所述的辣根过氧化物酶标记的检测抗体溶液，其浓度为：1.2～1.3μg/ml，是利用1％ bsa溶液稀释得到的，其加入量为100～110μl/每孔；所述的孵育，其孵育条件为：450～550rpm下孵育110～130min。

23、其中，步骤(5)中，所述的显色液为商业化试剂，品牌opteiatm，货号：555214，其加入量为100μl/每孔，其是由试剂a和试剂b室温下按1:1混合后制得的；其中所述的避光孵育，其孵育时间为8～12min；所述的终止液，其加入量为100μl/每孔。

24、有益效果：

25、(1)本发明开发了一种针对本公司全人源抗pd-1单克隆抗体产品赛帕利单抗注射液hcp检测的专属试剂盒，该专属试剂盒中抗体针对赛帕利单抗注射液的hcp覆盖率为82％，相对于商业试剂盒，专属试剂盒对赛帕利单抗注射液产品的hcp有着更好的识别能力，提高了专属性抗体的覆盖率、灵敏度，更好的实现了对产品质量的控制。

26、(2)本发明利用cho宿主细胞蛋白作为标准品和抗原制备抗体，具有特异性高、灵敏度高、检测效率高的特点，可同时检测多个样品，定量限达到3ppm(3ng/ml)，使用设备简单，操作方便，检测成本低。