四味石榴丸中多成分含量测定方法与流程

本发明属于中药检测，具体涉及一种四味石榴丸中多成分含量测定方法。

背景技术：

1、四味石榴丸，处方源于公8世纪著名藏医药学家宇妥·云丹贡布编著的《四部医典》，由石榴子、肉桂、豆蔻、荜茇四味药物粉碎成细粉、过筛、混匀，用水泛丸，干燥，即得。具有“温胃养胃、增生胃火、健胃消食”的功效；用于分清泌浊、胃寒、消化不良、食欲不振、积食不化等。藏医常用本方治疗胃部疾病，历史悠久，疗效确切，安全性好。

2、四味石榴丸是传统的生药丸剂，本发明建立四味石榴丸中没食子酸、鞣花酸、桂皮醛、胡椒碱4种指标成分的hplc定量测定方法，为提高四味石榴丸的质量标准提供参考。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种四味石榴丸中多成分含量测定方法。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、本发明所述的四味石榴丸为石榴子、肉桂、豆蔻、荜茇四味药材按重量比2:1:1:1组成的药物丸剂。四味石榴丸中的石榴子主要含有多酚类化合物，其中多酚类成分主要是以没食子酸、鞣花酸代表的酚酸类；桂皮醛是肉桂的主要有效成分，占肉桂总挥发油的75%以上；胡椒碱是一种酰胺类生物碱，是荜茇的主要有效成分。

4、本发明所述的四味石榴丸中多成分含量测定方法，采用了高效液相色谱法同时测定了四味石榴丸中主要有效成分没食子酸、鞣花酸、桂皮醛和胡椒碱的含量。

5、本发明所述的高效液相色谱法采用的色谱柱为c18液相色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm），该色谱柱是碳十八硅烷化学键合硅胶固定相的反相色谱柱，其硅胶颗粒粒径为5 μm，柱长为250 mm，柱内径为4.6 mm。

6、本发明所述的高效液相色谱法采用的流动相由流动相a和流动相b组成，其中流动相a为0.1 %磷酸水溶液，流动相b为乙腈、甲醇按体积比3：2混合的混合溶液，梯度洗脱的程序为：0 ～50 min，5%b →90%b；流速1.0 ml·min-1，柱温30 ℃，进样量10 μl。

7、本发明所述的高效液相色谱法采用的检测器为紫外检测器，检测波长为270 nm。没食子酸、鞣花酸、胡椒碱、桂皮醛在250-290 nm均有较高的吸收，本发明分别采用了250、260、270、280、290 nm波长检测了供试品溶液中4个主要指标成分的色谱峰的峰形和峰面积，结果显示在270 nm波长下，4个指标成分的色谱峰峰形均较好，且峰面积均在500-1000范围内，有利于提高各成分的检测精确度，因此，本发明选择270 nm作为检测波长。

8、本发明所述的高效液相色谱法采用的流动相a是水相，流动相b是有机相，流动相a为0.1 %磷酸水溶液，流动相b为乙腈、甲醇按体积比3：2混合的混合溶液。本发明发现用甲醇、乙腈作为单一有机相时，桂皮醛、没食子酸的色谱峰不但受到杂峰干扰，且拖尾因子大于1.05。因此，本研究选用乙腈、甲醇的混合溶液作为有机相，并通过研究确定乙腈、甲醇按照体积比（3:2）混合的有机相，没食子酸、鞣花酸、胡椒碱、桂皮醛色谱峰的分离度、拖尾因子、理论塔板数均符合《中国药典》规定。

9、本发明所述的供试品溶液制备方法为：先将四味石榴丸和甲醇 - 0.1%磷酸水（7:3, v/v）溶液按照重量体积比1:50加入到提取容器中，称重，采用功率250 w、频率50 khz的超声装置，超声提取60 min，放冷，再称重，用甲醇 - 0.1%磷酸水（7:3, v/v）溶液补足减失的量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

10、本发明所述的甲醇 - 0.1%磷酸水（7:3, v/v）是无水甲醇与体积分数为1%的磷酸水溶液，按照体积比为7:3混合配制成的溶液。

11、本发明所述的供试品溶液制备方法中采用甲醇体积分数为20-70%的甲醇-0.1%磷酸水溶液作为提取溶剂，供试品溶液中没食子酸含量变化不显著，而鞣花酸、胡椒碱、桂皮醛含量显著增加，当甲醇体积分数为70-90%的甲醇-0.1%磷酸水溶液作为提取溶剂，供试品溶液中鞣花酸、胡椒碱、桂皮醛含量变化不显著，没食子酸含量显著下降，这与没食子酸易溶于水以及鞣花酸、胡椒碱、桂皮醛在甲醇中溶解性显著高于水有关，因此选择甲醇-0.1%磷酸水溶液(7:3,v/v)作为提取溶剂。

12、本发明所述的供试品溶液制备方法中的甲醇 - 0.1%磷酸水溶液(7:3, v/v)是提取溶剂。与不含磷酸的甲醇溶液相比： 70%甲醇作为提取溶剂，制备的供试品溶液，室温放置12小时，供试品溶液中鞣花酸含量变化显著；采用甲醇-0.1%磷酸水溶液(7:3, v/v)作为提取溶剂制备的供试品溶液，室温放置72小时，供试品溶液中没食子酸、鞣花酸、桂皮醛和胡椒碱含量变化不显著，溶液稳定。因此，优选甲醇-0.1%磷酸水溶液(7:3, v/v)作为提取溶剂。

13、本发明所述的高效液相色谱法还包括对照品溶液的制备方法，其方法为：首先精密称定对照品没食子酸、桂皮醛和胡椒碱，分别加入甲醇-0.1%磷酸水溶液(7:3, v/v)溶解，摇匀，制备得没食子酸对照品储备液、桂皮醛对照品储备液、胡椒碱对照品储备液。再精密称取对照品鞣花酸，加入纯甲醇溶解，摇匀，制备鞣花酸对照品储备液。然后再按体积比2:8:1:6，分别取没食子酸对照品储备液、鞣花酸对照品储备液、桂皮醛对照品储备液、胡椒碱对照品储备液，置于同一容量瓶中，用甲醇 - 0.1%磷酸水溶液(7:3, v/v)稀释定容，即得得到没食子酸、鞣花酸、桂皮醛、胡椒碱的混合对照品溶液。

14、本发明所述的纯甲醇溶液是纯度超过99.9%的甲醇。

15、本发明所述的对照品溶液的制备方法中鞣花酸标准品先用纯甲醇溶解，再用甲醇- 0.1%磷酸水溶液(7:3, v/v)稀释。鞣花酸的水溶性和脂溶性均较低，不溶于醚，微溶于水和醇。与水相比，鞣花酸在甲醇中的溶解度明显提高。因此，本发明先用纯甲醇溶解鞣花酸标准品。本发明人发现配置的鞣花酸纯甲醇溶液室温20℃放置12小时左右，即有沉淀析出，溶液变浑浊，用纯甲醇稀释后，室温20℃放置12小时依然有沉淀析出，影响定量测定的准确性，这与鞣花酸在溶液状态下不稳定易析出有关。本发明人还发现ph对鞣花酸的溶解稳定性有较大影响，鞣花酸在酸性溶液中，溶解性随ph降低而增加，在中性和碱性溶液中，鞣花酸的溶解度较小，采用甲醇 - 0.1%磷酸水（7:3, v/v）溶液稀释后的鞣花酸溶液在室温20℃放置72小时，依然澄清透明，鞣花酸含量无显著变化。本发明人还发现直接采用甲醇 -0.1%磷酸水（7:3, v/v）溶液溶解鞣花酸，超声2小时或加热回流2小时或室温20℃放置72小时，溶液依然浑浊有沉淀，因此，本发明采用先用纯甲醇溶解，再用甲醇 - 0.1%磷酸水溶液(7:3, v/v)稀释，制备鞣花酸对照品溶液，不但能确保完全溶解，并能使得供试品溶液偏酸性，提高其溶液的稳定性。

16、本发明所述的高效液相色谱法还包括阴性溶液的制备方法，其方法为：分别缺石榴子、肉桂、荜茇的药材细粉，其余操作同供试品溶液的制备方法，制得阴性溶液；以及空白溶液的制备方法，其方法为：不加药材细粉，其余操作同供试品溶液的制备方法，制得空白溶液。

17、本发明的有益效果：

18、（1）本发明建立了高效液相色谱法同时对四味石榴丸中的指标成分没食子酸、鞣花酸、桂皮醛、胡椒碱进行定量测定研究并通过方法学验证，结果表明本方法科学、可行；

19、（2）本发明相较于单独分析，可有效减少仪器的进样次数和分析时间，检测时间短，检测结果准确，简单易行；

20、（3）本发明的线性范围广，重复性良好，样品处理的方法稳定可行，所得供试品溶液在常温状态下具有良好的稳定性；

21、（4）本发明的方法稳定准确，可用于四味石榴丸的质量评价，可为四味石榴丸的质量标准的提升提供参考。