一种用于在现场进行多重检测的免洗涤生物传感方法

本发明涉及临床诊断、食品安全、生物传感领域，具体涉及一种用于在现场进行多重检测的免洗涤生物传感方法。

背景技术：

1、严重急性呼吸道病毒 (如新型冠状病毒、流感病毒、副流感病毒) 具有高度传染性、多变性，突显了对准确识别和筛查呼吸道病毒感染患者以便进行精确管理和治疗的需求。由于这些呼吸道病毒会引起相似的症状，如感冒、发热、哮喘、反复呼吸道感染等，甚至致命的肺炎，因此针对不同患者确定适当治疗方法具有挑战性。此外，同时感染多种呼吸道病毒会增加病毒传染性，从而加重患者的病情。真菌毒素对患者免疫系统的影响也引起了广泛关注。真菌毒素 (如黄曲霉毒素b1、呕吐毒素、和赭曲霉毒素a) 对免疫系统的毒性表现为对免疫器官的损害、免疫细胞的程序性细胞死亡和免疫因子分泌的改变，从而增加了感染呼吸道病毒的风险。因此，在患病早期同时检测呼吸道病毒和真菌毒素对指导患者的临床治疗至关重要。

2、目前，实时定量聚合酶链式反应 (q-pcr) 被认为是检测呼吸道病毒的金标准。然而，它需要专业设备和认证实验室，许多偏远地区并不具备这些条件。侧流免疫分析法(lfia) 作为一种床旁检测技术 (poct)，具有成本低、反应快、操作简便，可提供快速便捷的诊断优势。lfia因能为用户提供实时诊断结果而备受关注。然而，lfia具有灵敏度低、动态范围窄、基质干扰、非特异性结合和难以多重检测等不足。此外，对食品中的真菌毒素等危害因子进行精准检测的方法主要是仪器分析法、免疫分析法和生物传感法，仪器分析法主要通过气相色谱仪、高效液相色谱仪、高效液相色谱-质谱联用仪等大型精密仪器进行检测，检测灵敏度高且线性范围宽，但是使用仪器对样品进行分析需要做大量的前处理且仪器昂贵，检测成本较高，不适合现场快速检测。免疫分析法主要包括酶联免疫吸附测定法(elisa) 等，elisa具有操作相对简单、高通量等优势，但其灵敏度一般在ng/ml级别，线性范围较窄，且不适用于痕量检测。因此，开发一种能快速、灵敏地检测多个目标的诊断平台，进行早期大规模筛查，对于预防危害因子传播至关重要。

3、在前期已经完成的工作中，发明人提出了一种基于绝缘微球状态变化导致微通道电阻改变的生物传感检测方法 (公开号cn112595759a)，在这种方法中，溶液在电渗流作用下进入微通道并在通道内占据一定的空间，溶液中的绝缘微球会使微通道内的导电离子浓度发生改变，导致微通道的电阻随着微球的不同聚集状态发生相应变化，绝缘微球的浓度可以通过测量微通道两端的电流变化来测量。基于免疫反应改变的微球浓度和目标物浓度具有一定的线性关系。上述发明分辨率较低，需要样品之间需要较大的浓度差异才能检测到明显的信号变化，因此在应用于实际样品检测中准确度不高，更重要的是该方法无法对多目标物进行同时检测。此外，发明人在后续的研究中还提出了一种基于乳胶微球紫外吸收光谱峰面积积分的多目标物同时检测方法 (公开号cn202111511613.8)，该方法以偶联有生物识别分子的不同尺寸的乳胶微球为信号探针，表面偶联有生物识别分子的免疫磁颗粒作为磁分离载体，与待测目标物进行充分的免疫反应得到混合溶液；磁分离后对未参与反应的信号探针溶液进行全波长扫描，选取与乳胶微球对应的波长范围进行峰面积积分，从而实现对每个信号探针的准确分析定量。该方法基于不同尺寸乳胶微球的紫外吸收峰差异，很好的避免了溶液基质的背景干扰，可以实现多目标物同时定量。但是该方法中使用的紫外分析仪设备体积较大，且需要多步的磁分离步骤，适合实验室条件下的检测，很难在现场进行快速检测。

技术实现思路

1、本发明提供一种用于在现场进行多重检测的免洗涤生物传感方法，该方法操作简便，可用于快速筛查多种致病因子。该策略仅依靠ps微球的重力和浮力差异进行分离，无需复杂的反应和洗涤步骤。不同尺寸的微球在溶液中的沉降加速了溶液等压线变化，使微球碰撞更剧烈，有利于识别分子与目标物的结合。目标物可以与微球上的识别因子发生特异性相互作用，形成微米级 (psμm) 和毫米级 (ps1000μm) 微球的沉淀复合物。随后引入的naoh会破坏这种相互作用，(微球上结合的生物识别分子的蛋白结构以及形成的化学键在碱性环境下会变性裂解，经naoh处理后复合物最终剩下毫米级微球和微米级微球)，使psμm微球从复合物中释放出来。ps1000μm微球在3秒钟内迅速下沉，psμm微球可保持悬浮状态数小时，这为分离不同大小的微球提供了一个简单易用的工具。释放的psμm微球和目标物浓度呈一定的关系 (正比或反比)，其大小和数量可以通过便携式颗粒计数器进行量化，从而可以对不同的分析物进行同时检测。此外，使用本方法对临床诊断以及食品中的危害因子进行精准检测，能够根据待测目标物种类不同设计不同的靶标探针，进而最大程度地满足同时检测多种目标物的需求。

2、本发明技术方案如下：

3、一种用于在现场进行多重检测的免洗涤生物传感方法，所述方法包括以下步骤：

4、1)目标物与分离载体a、信号探针b三者发生免疫反应，形成“分离载体a-目标物-信号探针b”复合物即a-目标物-b复合物，a-目标物-b复合物沉降在溶液底部，未反应的信号探针b悬浮在上清液a中，去除上清液a中未反应的信号探针b；

5、2)向a-目标物-b中复合物加入碱性溶液或有机溶液或其他能破坏生物识别分子结合化学键的试剂后释放a-目标物-b中复合物上结合的信号探针b，信号探针b被释放到上清液b中；

6、3)使用便携式颗粒计数器检测上清液b中的信号探针b，对信号探针b的粒径和数量进行识别和计数；

7、4)以目标物标准储备液的对数值为横坐标，不同粒径信号探针b的数量为纵坐标，计算目标物的浓度；

8、完成目标物的检测。

9、优选地，所述步骤1)中，分离载体a为偶联有生物识别分子的微球，信号探针b为偶联有生物识别分子的微球，微球为聚苯乙烯乳胶微球或聚丁二烯乳胶微球、聚异戊二烯乳胶微球、聚丙烯酸乳胶微球中任一种。

10、优选地，在同一溶液体系中分离载体a的沉降速度大于信号探针b的沉降速度。

11、优选地，所述方法中，信号探针b悬浮在上清液a的时间大于反应时间+检测时间，反应时间为步骤1)和步骤2)的总体过程时间；检测时间为步骤3)操作时间。

12、优选地，所述方法中，信号探针b悬浮在上清液b的时间大于a-目标物-b复合物释放信号探针b后的物质在上清液b中的悬浮时间。

13、优选地，所述步骤2)中，a-目标物-b中复合物的密度大于溶液密度。

14、优选地，所述步骤2)中碱性溶液为氢氧化钠或氢氧化钾，有机溶剂为无水乙醇溶液或甲醇、丙酮溶液或其他。

15、所述用于在现场进行多重检测的免洗涤生物传感方法应用于各种目标物的同时定量检测，包括真菌毒素、致病微生物、抗生素、农兽药、疾病标志物或其他。

16、优选地，所述生物识别分子包括但不仅限于待测物特异性抗体和待测物完全抗原、检测抗体和捕获抗体、抗体和抗原、抗原和抗体、dna捕获探针和dna检测探针、dna检测探针和dna捕获探针、噬菌体和抗体、抗体和噬菌体、噬菌体和多肽，分离载体a和信号探针b上的生物识别分子只能与目标物进行特异性结合，不能与其他目标物结合。

17、本发明的有益效果是：

18、1、它是首个基于不同尺寸微球的重力和浮力差异实现信号探针和反应载体分离的检测方法，将不同尺寸的微球作为信号探针，实现了免洗的多靶点快速筛选。

19、2、微球的尺寸差异明显 (毫米级和微米级)，微球沉降导致液体等压线发生剧烈变化，微球之间的碰撞频率更高，反应效率更高。