基于旋光或旋光色散的手性分子含量计量基准方法与流程

本发明涉及生化检测，特别是涉及单独应用旋光或旋光色散，或者使用高效液相色谱与旋光或旋光色散联用准确定量手性分子含量的方法。

背景技术：

1、手性分子是指那些不能与其镜像重合的分子。这种特性主要是由于分子中存在一个或多个手性中心，通常是一个碳原子，它连接四个不同的原子或原子团。手性分子成对出现，形成一对互为镜像的异构体，被称为对映体(enantiomers)。手性在化学、生物化学、药物学以及材料科学中非常重要，因为一个分子的手性形式(或对映体)可能具有与其镜像异构体完全不同的化学反应性、生物活性或药理效应。例如，在生物体内，一种对映体可能是有效的药物，而另一种对映体可能无效甚至有害。手性的存在使得对映体的分离和鉴定变得非常重要，尤其是在药物制备和生物分子的研究中，如旋光色散(ord)和圆二色光谱(cd)就是通过分析手性分子的光学性质来区分不同的对映体。

2、准确测定手性分子含量在多个领域具有极其重要的意义，尤其是在药物化学、药品监管、环境与食品等领域中。首先，准确测定手性分子的含量可以准确评价药物药效和安全性。不同的对映体可能具有截然不同的生物活性，一个对映体可能具有治疗效果，而另一个可能无效或具有不良副作用。因此，准确测定药物中手性成分的含量对于确保药物的效能和安全性至关重要。在药物开发过程中，了解不同手性形式的具体作用机理可以帮助研究人员设计更高效、更安全的药物。通过准确测定手性分子含量，研发团队能够更好地评估和优化候选药物的性质。第二，准确测定手性分子含量对于药品监管十分重要。许多国家的药品监管机构要求对手性药物的每个对映体进行严格的质量控制和标注，以保证其安全性和有效性，必然要求在药物的开发和生产过程中准确测定手性分子的含量。第三，在环境科学中，手性农药和污染物的不同对映体可能对环境和生物体具有不同的影响。准确测定这些化合物的手性含量对于评估其环境风险和制定相应的管理策略至关重要。第四，在食品和香料工业中，手性分子的不同对映体可能会导致味道和香味的显著差异。准确的手性分析可以帮助保持产品质量和一致性。第五，在生物化学的基础研究中，准确测定手性分子含量有助于理解生命过程中手性分子的作用机制，以及它们如何影响分子识别、信号传导和代谢途径，从而有助与生物化学基础研究的进展。最后，准确测定手性分子含量对于准确定量生物大分子也非常重要。例如天然的蛋白质都是由l氨基酸组成的，蛋白质的定量可以通过将蛋白质水解成l氨基酸后，通过准确测定l氨基酸的含量间接计算出蛋白质的含量。

3、当前准确测定手性分子含量的计量基准方法十分有限，常用的方法包括质量平衡法、同位素稀释质谱法和圆二色光谱法。采用质量平衡法进行测定时，需要将目标手性分子的对映体进行完全的拆分，采用手性液相色谱或气相色谱的方法确定手性分子的含量，且该方法仅适用于固体高纯手性分子纯度的测定，不适用于溶液样品的测定。采用同位素稀释质谱法进行测定时，仪器成本较高且需要被测目标物的标准品或标准物质。采用圆二色光谱进行测定时，使用的波长范围较为有限，对样品本身的要求也比较高，如果样品混浊或有颜色，测定结果不够准确。

技术实现思路

1、本发明针对目前手性分子含量计量基准方法匮乏的问题，提供一种基于旋光或旋光色散测定的、可溯源到si单位的手性分子含量计量基准方法。通过单独使用旋光或旋光色散，或者通过高效液相色谱与旋光或旋光色散联用，以目标化合物的手性对映体作为标准对目标化合物进行定量，从而计算出手性分子的含量；如果手性分子为生物大分子的组成单元，可根据生物大分子的单元组成进一步计算出生物大分子的含量。与圆二色光谱方法相比，基于旋光或旋光色散的方法能够在更广泛的波长范围内对手性分子进行定量，同时仪器成本更加低廉。该方法的建立有助于改变当前手性分子含量计量基准方法匮乏的问题。

2、为了完成本发明的发明目的，本发明的具体技术方案为：

3、本发明的一种基于旋光或旋光色散的手性分子含量计量基准方法，其中：它包括以下步骤：

4、(一)、样品溶液的准备

5、待测样品中含有目标手性分子，样品为固体或液体，用溶剂将上述待测样品(记为a)配制或稀释成含有0.001mg/g～5mg/g浓度的目标手性分子溶液，采用分光光度计或/和高效液相色谱仪对上述待测样品进行浓度初测，得到初测浓度c0；

6、(二)、标准溶液的准备

7、用上述溶剂对含有上述目标手性分子的对映体标准物质(记为a*)进行溶解，同样将标准物质配制或稀释成含有上述目标手性分子对映体的的溶液，使得其浓度c*与上述待测样品中目标手性分子的浓度c0接近；

8、(三)、旋光仪或旋光色散仪的准备

9、当单独使用旋光仪或旋光色散仪时，打开旋光仪或旋光色散仪，将样品池的温度设置在(15～30)℃之间，温度波动度不大于±0.05℃；如果在紫外区进行旋光或旋光色散的测定，打开氮气开关，在整个光源和光路检测范围内通入氮气，否则不打开氮气开关；在样品池中装入上述溶剂；当使用旋光仪检测时，调整零点使得旋光示值为0m°；当使用旋光色散仪检测时，将检测波长设置为(200～700)nm的敏感波长，然后调整零点，使得在上述波长下，旋光色散示值为0m°；

10、或者当联合使用高效液相色谱仪与旋光仪或高效液相色谱仪与旋光色散仪时，手动将溶剂注入旋光仪或旋光色散仪的检测池，按照上述方式调整旋光仪或旋光色散仪器的零点；

11、(四)、空白的测定

12、当单独使用旋光仪或旋光色散仪进行检测时，在样品池中装入上述溶剂，重复测量旋光或旋光色散结果(6～20)次，计算上述测量数据的平均值x和标准偏差s；

13、或者当联合使用高效液相色谱仪与旋光仪或高效液相色谱仪与旋光色散仪时，在旋光仪或旋光色散仪前，串接入高效液相色谱仪，将高效液相色谱仪的紫外检测器出口与旋光仪或旋光色散仪的入口相连，通过自动进样器进样分析上述手性分子对映体标准物质得到该物质在高效液相色谱仪的紫外检测器上的保留时间t0，以及在旋光仪或旋光色散仪上的保留时间t1，δt＝t1-t0，即为旋光仪或旋光色散仪的延迟时间；确定好延迟时间后，通过自动进样器进样分析上述溶剂，在旋光或旋光色散色谱图上的t1时刻位置，读取上述溶剂的旋光或旋光色散结果，按上述方式，重复测量旋光或旋光色散结果(6～20)次，计算上述测量结果的平均值y和标准偏差s’；

14、(五)、样品的测定

15、当待测样品只含有目标手性分子时，单独使用旋光仪或旋光色散仪测定上述待测样品溶液中的目标手性分子的含量，根据步骤(一)测量的待测样品中目标手性分子的初测浓度c0，取质量为m的上述待测样品溶液，在其中加入质量为m*0、浓度为c*的含有对映体标准溶液，使得混合后对映体在混合溶液中的浓度与目标手性分子在混合溶液中的浓度接近，在旋光仪或旋光色散仪的样品池中加入上述混合溶液，待温度稳定后读取上述混合溶液的旋光或旋光色散结果，按照上述方式重复测量上述混合溶液的旋光或旋光色散结果(6～20)次，计算上述测量结果的平均值x1；当目标手性分子的旋光或旋光色散测量结果为下述情况时，分别进行以下处理：

16、(1)、如果目标手性分子的旋光或旋光色散结果为正值且x1>(x+3s)，说明混合溶液中作为标准品的对映体含量少于待测样品中目标手性分子的含量，因此，重新取一份样品，重复上述测量，在上述测量中加入质量为(m*0+δm*)的对映体标准溶液；

17、(2)、如果目标手性分子的旋光或旋光色散结果为正值且x1<(x-3s)，说明混合溶液中作为标准品的对映体含量多于待测样品中目标手性分子的含量，因此，重新取一份样品，重复上述测量，在上述测量中加入质量为(m*0-δm*)的对映体标准溶液；

18、(3)、如果目标手性分子的旋光或旋光色散结果为负值且x1>(x+3s)，说明混合溶液中作为标准品的对映体含量多于待测样品中目标手性分子的含量，因此，重新取一份样品，重复上述测量，在上述测量中加入质量为(m*0-δm*)的对映体标准溶液；

19、(4)、如果目标手性分子的旋光或旋光色散结果为负值且x1<(x-3s)，说明混合溶液中作为标准品的对映体含量少于待测样品中目标手性分子的含量，因此，重新取一份样品，重复上述测量，在上述测量中加入质量为(m*0+δm*)的对映体标准溶液；

20、不断重复上述(1)至(4)的过程，直到(x-3s)≤x1≤(x+3s)，此时说明在检测范围内，混合溶液中作为标准品的对映体含量与目标待测样品中手性分子的含量相等；

21、当待测样品含有目标手性分子和其它化合物时，联合使用高效液相色谱仪与旋光仪或旋光色散仪来测定上述待测样品溶液中的目标手性分子的含量，根据步骤(一)测量的待测样品中目标手性分子的初测浓度c0，取质量为m的上述待测样品溶液中加入质量为m*0、浓度为c*的上述目标手性分子的对映体标准溶液，使得混合后对映体在混合溶液中的浓度与目标手性分子在混合溶液中的浓度接近，通过高效液相色谱仪自动进样器进样分析该混合溶液，根据样品在高效液相色谱仪的紫外检测器上的保留时间t，在旋光或旋光色散色谱图上读取(t+δt)时刻的旋光或旋光色散值，其中δt在步骤(四)中得到，按照上述方式重复测量旋光或旋光色散结果(6～20)次，计算上述测量结果的平均值y1；当目标手性分子的旋光或旋光色散测量结果为下述情况时，分别进行以下处理：

22、(5)、如果目标手性分子的旋光或旋光色散结果为正值且y1>(y+3s’)，说明混合溶液中作为标准品的对映体含量少于待测样品中目标手性分子的含量，因此，重新取一份样品，重复上述测量，在上述测量中加入质量为(m*0+δm*)的对映体标准溶液；

23、(6)、如果目标手性分子的旋光或旋光色散结果为正值且y1<(y-3s’)，说明混合溶液中作为标准品的对映体含量多于待测样品中目标手性分子的含量，因此，重新取一份样品，重复上述测量，在上述测量中加入质量为(m*0-δm*)的对映体标准溶液；

24、(7)、如果目标手性分子的旋光或旋光色散结果为负值且y1>(y+3s’)，说明混合溶液中作为标准品的对映体含量多于待测样品中目标手性分子的含量，因此，重新取一份样品，重复上述测量，在上述测量中加入质量为(m*0-δm*)的对映体标准溶液；

25、(8)、如果目标手性分子的旋光或旋光色散结果为负值且y1<(y-3s’)，说明混合溶液中作为标准品的对映体含量少于待测样品中目标手性分子的含量，因此，重新取一份样品，重复上述测量，在上述测量中加入质量为(m*0+δm*)的对映体标准溶液；

26、不断重复上述(5)至(8)的过程，直到(y-3s’)≤y1≤(y+3s’)，此时说明在检测范围内，混合溶液中作为标准品的对映体含量与目标待测样品中手性分子的含量相等；

27、(六)、结果的计算

28、在满足(x-3s)≤x1≤(x+3s)或(y-3s’)≤y1≤(y+3s’)时，说明混合溶液中作为标准品的对映体含量与待测样品的目标手性分子的含量相等，此时待测样品中目标手性分子的浓度c＝m*c*/m，其中m*为满足(x-3s)≤x1≤(x+3s)或(y-3s’)≤y1≤(y+3s’)时加入的对映体标准溶液的质量，c*为配制的对映体标准溶液的质量浓度，m为样品溶液的质量。

29、本发明的一种基于旋光或旋光色散的手性分子含量计量基准方法，其中：所述溶剂为纯水。

30、本发明的一种基于旋光或旋光色散的手性分子含量计量基准方法，其中：在步骤(一)和步骤(二)的待测样品配制和标准物质配制过程中，如果待测样品或标准物质不能完全溶解在水中时，加入盐酸、甲酸、乙酸或三氟乙酸作为助溶剂，直到待测样品或标准物质完全溶解在水中为止。

31、本发明的一种基于旋光或旋光色散的手性分子含量计量基准方法，其中：所述标准偏差

32、

33、

34、其中：

35、s——单独使用旋光或旋光色散测定n次时结果的标准偏差；

36、n——单独使用旋光或旋光色散时的测定次数；

37、xi——单独使用旋光或旋光色散时的n次不同测量结果；

38、x——单独使用旋光或旋光色散时n次测量结果的平均值；

39、s’——使用高效液相色谱与旋光或旋光色散联用测定m次时结果的标准偏差；

40、m——使用高效液相色谱与旋光或旋光色散联用时的测定次数；

41、yj——使用高效液相色谱与旋光或旋光色散联用时的m次不同测量结果；

42、y——使用高效液相色谱与旋光或旋光色散联用时的m次测量结果的平均值。

43、本发明的一种基于旋光或旋光色散的手性分子含量计量基准方法，其中：在高效液相色谱仪分离过程中，使用非手性柱与非手性流动相，确保在液相分离过程中，待测目标手性分子和对映体不会被拆分。

44、本发明的一种基于旋光或旋光色散的手性分子含量计量基准方法，其中：所述手性分子为不能与自身的镜像相重叠，并具有使偏振光振动面旋转性质的不对称分子。

45、本发明的一种基于旋光或旋光色散的手性分子含量计量基准方法，其中：所述对映体也称对映异构体，其空间结构具有实物和镜像关系的旋光异构体，它与手性分子互为对映体。

46、本发明的一种基于旋光或旋光色散的手性分子含量计量基准方法，其中：经过步骤(一)高效液相色谱仪分析后，当主成分峰面积归一化比例大于99％的待测样品溶液认为只含有目标手性分子，否则认为含有目标手性分子和其它化合物。

47、本发明的基于旋光或旋光色散的手性分子含量计量基准方法测量范围广、样品要求低、结果准确且可溯源到si单位，是手性分子计量基准方法。