一种定性定量病原微生物的快速检测方法与流程

本发明属于病原检测，具体涉及一种定性定量病原微生物的快速检测方法。

背景技术：

1、空气对很多感染性疾病的传播起至关重要的作用，人们在咳嗽、喷嚏时释放的微生物通过空气流动扩散到空气中，从而引起广泛地传播。尤其是医院环境中，室内空气中的病原菌不仅影响患者的健康，还影响和患者有关的医护人员的健康。因此，空气微生物作为医院感染的潜在危险，已是人们广泛研究的对象。临床诊断和生物安全领域迫切需要直接的细菌检测策略，而不需要耗时的培养过程。因此，开发快速，灵敏和准确的细菌诊断方法已成为公共卫生的主要目标。

2、细菌的传统检测方法包括染色，光学显微镜检查，微生物培养和扩增诸如免疫测定(酶联免疫吸附测定，elisa)和核酸鉴定(聚合酶链反应，pcr)等技术。但是，染色培养只能区分革兰氏阳性(g+)和革兰氏阴性(g-)细菌。微生物培养需要24-72小时才能鉴定出致病细菌。尽管扩增策略可以实现高特异性和灵敏度，但它们都需要繁琐的样品制备，并且手工操作十分复杂。虽然下一代测序和芯片可以同时检测多种病原菌，这些技术仍然需要事先分离细菌dna，制备酶反应混合物，而且核酸扩增的仪器价格昂贵。因此，细菌的直接检测技术需要得到更多的发展。

3、表面增强拉曼光谱(sers)由于其高灵敏度和快速响应时间，被认为是一种强有力的化学和生物制剂检测技术。sers是拉曼光谱学和纳米技术的结合。纳米结构金属基底的应用可以显著增强固有的弱拉曼信号，并抑制荧光干扰。其增强机制在于局部表面等离子体共振(lspr)引起的电磁场增强，以及分析物与基质之间的电荷转移引起的化学增强。sers具有产生完整生物化学指纹的能力以及无需富集即可进行单细胞检测的能力。因此，它在细菌检测方法学中引起了广泛关注。

4、目前已有方法能够检测空气中的细菌总数，但并不能检测出细菌种类，无法分辨出其中是否含有致病菌。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于拉曼效应的对病原微生物定性定量的快速检测方法。本发明合成的聚合物纳米粒子，灵敏度高、重现性稳定性好、能够与102-108cfu/ml浓度范围的细菌有效结合，并具有良好的线性关系，可用于快速检测空气中的细菌种类及浓度，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、一种定性定量病原微生物的快速检测方法，包括以下步骤：

4、s1、制备4-巯基苯基乙酸乙醇聚合物纳米粒子基底液，具体步骤如下：

5、s1.1、制备10-4mol/l4-巯基苯基乙酸乙醇溶液；

6、s1.2、制备1％氯金酸溶液；

7、s1.3、制备38.8mmol/l柠檬酸三钠水溶液；

8、s1.4、制备纳米探针；

9、s1.5、4-巯基苯基乙酸的修饰；

10、s2、制备已知细菌数量的标准菌液，具体步骤如下：

11、s2.1、菌种来源；

12、s2.2、菌种活化；

13、s2.3、菌种扩大培养；

14、s2.4、测定每种菌液的od值；

15、s2.5、根据od值平均值得出目标菌液中菌含量；

16、s2.6、菌液稀释；

17、s3、获取待检测细菌浓度与拉曼信号强度的标准曲线，具体步骤如下：

18、s3.1、将100ul不同浓度的细菌分别与100ul纳米金探针在37℃下振荡孵育15min，再加入10ul浓度为1m的nacl，涡旋30s之后，完成制备；

19、s3.2、混合后进行拉曼检测，得到不同浓度细菌溶液对应的拉曼强度，建立细菌浓度与拉曼强度之间的标准曲线；

20、s4、细菌种类和浓度检测，具体步骤如下：

21、s4.1、采用fkc-1浮游菌采集器对空气中细菌进行收集，首先配制luria-bertani培养基，在直径为90mm的培养皿中加入5ml配置好的培养基，设置浮游菌采集器收集参数为4000l，进行空气中收集；

22、s4.2、取1ml收集到的空气中细菌溶液以4000r/min的转速离心10min收集菌体，加入1ml浓度为10mm的nh4hco3溶液进行重悬，再加入10ul浓度为1m的nacl，混合后进行拉曼检测，同时取100ul未进行任何处理的空气中细菌初始溶液进行涂布并在37℃下培养24h；

23、s4.3、根据步骤s3建立的标准曲线即可得到步骤s4.2中细菌的种类及对应浓度，根据已知的溶液含量计算细菌的数量，根据细菌数量计算出所取待检测细菌溶液的浓度。

24、优选的，所述步骤s1、制备4-巯基苯基乙酸乙醇聚合物纳米粒子基底液具体步骤如下：

25、s1.1、制备10-4mol/l4-巯基苯基乙酸乙醇溶液：先制备10-2mol/l4-巯基苯基乙酸乙醇溶液，取6.4mg4-巯基苯基乙酸置于15ml离心管中，加入3ml无水乙醇，超声至溶解，取200μl配置好的溶液加入15ml离心管，再加入1.8ml的无水乙醇，超声一分钟，再取第二次配好的溶液200ul置于15ml离心管中，再加入1.8ml的无水乙醇，超声一分钟，所得溶液即为10-4mol/l4-巯基苯基乙酸乙醇溶液；

26、s1.2、制备1％氯金酸溶液：取0.1g氯金酸固体置于15ml离心管中，加入9.9ml纯水，超声至溶解，制备好后，冷藏4℃避光保存；

27、s1.3、制备38.8mmol/l柠檬酸三钠水溶液：取5.7mg柠檬酸三钠固体置于15ml离心管中，加入5ml纯水，超声至溶解；

28、s1.4、制备纳米探针：首先将50ml超纯水置于150ml两口烧瓶中，在140-145℃的温度下、磁力搅拌1500转加热至剧烈沸腾，打开两口瓶玻璃塞加入500μl1％氯金酸溶液，搅拌均匀后，迅速加入600μl38.8mmol/l柠檬酸三钠水溶液，保持加热条件，当溶液变成酒红色后，开始计时，反应持续20分钟之后，结束加热，使两口烧瓶室温放凉；

29、s1.5、4-巯基苯基乙酸的修饰：两口烧瓶放置到室温后，将50ml溶液平均分装到5个15ml离心管里，向离心管里加入200μl10-4mol/l4-巯基苯基乙酸乙醇溶液，加入对巯基苯甲酸后迅速盖上离心管盖，涡旋机开到最大，涡旋10-15s后，上下倒立离心管两次，观察离心管内溶液颜色和状态，直立放置1h，将溶液以7000rmp离心30分钟，取出上清液，将底部沉淀物重新分散在浓度为10mm的nh4hco3溶液中，用于细菌的检测。

30、所述s2、制备已知细菌数量的标准菌液具体步骤如下：

31、s2.1、菌种来源：选取空气中常见的细菌，选用保存在-80℃的冰箱里，菌液的od值在0.5-0.7之间；

32、s2.2、菌种活化：将菌液常温放置解冻，按照平板划线法稀释，放入恒温微生物培养箱并将温度设置为37℃，然后培养10小时，直至养出单菌落，每个菌种平行处理3个平板；

33、s2.3、菌种扩大培养：从琼脂平板上挑取单菌落放入液体培养基中扩大培养，放进恒温微生物摇床170-190转过夜培养；

34、s2.4、测定每种菌液的od值：打开紫外分光光度计，先取1ml纯水标定，再取1ml目标菌液测定od值，每个样品测3次取平均值；

35、s2.5、根据od值平均值得出目标菌液中菌含量；

36、s2.6、菌液稀释：将菌液稀释至1×107cfu/ml，然后再依次用浓度为10mm的nh4hco3稀释至106、105、104、103、102，备用。

37、本发明的技术效果和优点：

38、1.所合成的sers基底具有良好的拉曼信号，有利于提高拉曼定量分析的准确性，重现性；

39、2.本发明能够实现对空气中细菌的数量和种类同时进行快速检测。在临床应用中可以快速检测出空气环境中是否还有致病菌，可以有效维护临床医疗中的环境。