一种用于与捕获抗体偶联后磁珠的封闭剂及其制备方法和用途与流程

本发明涉及生物蛋白检测，特别是涉及一种在双抗夹心法中，用于与捕获抗体偶联后磁珠的封闭剂及其制备方法和用途。

背景技术：

1、现今，使用特异性抗体对检测某一特定蛋白质的检测技术已广泛应用于蛋白表达水平的研究，其中最常用的是基于双抗夹心法的elisa技术以及基于elisa双抗夹心原理衍生出的各种蛋白检测技术。在双抗夹心法中，磁珠可以作为双抗夹心结构中捕获抗体的载体，具体地，双抗夹心法的具体原理是：将磁珠偶联上针对特定检测物的捕获抗体，在检测靶分子时，将磁珠与微量待检样本混合，在悬液中将靶分子与磁珠表面偶联的捕获抗体进行特异性地结合，同时，荧光标记的检测抗体也会与靶分子结合，最终形成带有荧光标记的双抗夹心结构。用流式细胞仪等进行分析时，仪器通过激光识别磁珠上报告分子的荧光强度，进而得知靶分子的表达水平。

2、封闭是指使用溶液再包被被抗体偶联的磁珠的过程。在捕获抗体偶联磁珠时，所用的抗体浓度较低，因此磁珠表面尚有未被占据的空隙，封闭过程可以让与检测无关的蛋白质充填磁珠上的这些空隙，从而避免其他干扰物质的吸附。不合适的封闭剂会造成检测过程中出现假阳性的情况，由其是针对于人炎症相关的生物标志物进行含量检测时，不合适的封闭剂会导致背景模糊，信号值弱甚至丧失，实验的重复性差，对实验结果造成严重的影响。

3、因此封闭剂对于以磁珠为载体的双抗夹心法检测靶分子的灵敏度至关重要，在针对于人炎症相关的生物标志物进行含量检测时，如何优化封闭剂的组分，以提高其信号值或灵敏度从而提供更加准确可信的实验结果，是本发明想要解决的问题。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于与捕获抗体偶联后磁珠的封闭剂及其制备方法和用途。以解决现有技术中，基于双抗夹心法，在对人炎症相关的生物标志物进行分析检测时，用于与捕获抗体偶联后磁珠的封闭剂检测效果差，背景模糊，信号值弱，灵敏度低的问题。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明是通过以下技术方案获得的。

3、本发明第一方面提供一种用于与捕获抗体偶联后磁珠的封闭剂，包括如下原料组分：以封闭剂的总质量为基准计，稳定剂的含量为2～5wt％，表面活性剂的含量为0.01～0.1wt％，防腐剂的含量为0.01～0.2wt％，余量为缓冲液。

4、如稳定剂的含量可以为2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、2.05wt％；表面活性剂的含量可以为0.01～0.05wt％，0.05～0.1wt％；防腐剂的含量可以为0.01～0.1wt％，0.1～0.2wt％。

5、优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液(pbs)、tris-盐酸缓冲液、2-(n-吗啉)乙磺酸缓冲液(mes缓冲液)、3-吗啉丙磺酸缓冲液(mops缓冲液)、磷酸盐缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(hepes缓冲液)中的一种或多种。上述缓冲液能够在体系中维持一定的ph环境，还可以调节渗透压，具有和好的盐平衡能力，从而可以避免蛋白变性或降解。

6、更优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液(pbs)和tris-盐酸缓冲液中的一种或两种。

7、优选地，所述缓冲液的摩尔浓度为0.8～1.5m。如可以为0.8～1.0m，1.0～1.5m。

8、优选地，所述缓冲液的ph值为7.0～8.0。如可以为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0。

9、在基于双抗夹心法对于人炎症相关的生物标志物进行分析检测时，缓冲液在上述实验中起着缓冲作用，用以维持调节实验过程中蛋白质的活性，维持渗透压，防止蛋白降解、聚集、沉淀等。缓冲液的浓度和ph值均不是随意设定的，对于摩尔浓度来说，如果缓冲液的浓度过高，如超过2.5m时，会出现盐析，导致抗原抗体沉淀；如果缓冲液的浓度过低，则会削弱抗原抗体的结合能力。对于缓冲液的ph值来说，如果缓冲液的ph值较大，会影响抗原抗体的物理和化学性质，影响实验结果的准确性；如果缓冲液的ph值较小，则会引起抗原非特异性的自凝，造成假阳性反应。

10、优选地，所述稳定剂包括牛血清白蛋白(bsa)、prionex和酪蛋白中的一种或多种。

11、更优选地，所述稳定剂为牛血清白蛋白(bsa)和prionex中的一种或两种。

12、稳定剂可以与捕获抗体偶联后的磁珠复合物表面上的空白位点结合，从而起到保持抗体蛋白活性、稳定与抗体偶联后的磁珠复合物构象的作用，同时还能够降低抗体偶联磁珠后的非特异性吸附能力，以减缓信号衰减，提高试验检测的灵敏度。

13、优选地，所述表面活性剂包括吐温20(tween-20)、曲拉通x100和3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(chaps)中的一种或多种。表面活性剂是具有疏水基团和亲水基团的化合物，在封闭剂中加入表面活性剂对吸附的非特异性蛋白具有洗脱作用，从而减少蛋白检测实验中非特异性信号。

14、优选地，所述防腐剂包括proclin300、叠氮化钠、硫柳汞钠和对羟基苯乙酮中的一种或多种。防腐剂可以在长时间内抑制细菌、真菌及酵母生长。更优选为proclin300，proclin300防腐剂对大多数的酶或抗体交联反应的功能无影响。此外，proclin300不影响pe活性，不会干扰pe标记二抗的检测，不影响下游的检测指标。

15、本发明第二方面提供一种上述用于与捕获抗体偶联后磁珠的封闭剂的制备方法，将如上所述的缓冲液、稳定剂、表面活性剂和防腐剂按比例混合得到所述封闭剂。

16、本发明第三方面提供一种如上所述的用于与捕获抗体偶联后的磁珠的封闭剂，在基于双抗夹心法的蛋白检测中，用于封闭所述与捕获抗体偶联后的磁珠的用途。

17、优选地，所述蛋白检测包括对人炎症相关的生物标志物的分析检测。

18、优选地，所述人炎症相关的生物标志物包括白细胞介素-8、白细胞介素-6、c反应蛋白、降钙素原、肿瘤坏死因子-α和超敏c反应蛋白中的一种或多种。更优选为白细胞介素-8。

19、本发明第四方面提供一种蛋白检测方法，所述蛋白检测方法基于双抗夹心原理，使用如上所述的用于与捕获抗体偶联后磁珠的封闭剂。

20、优选地，所述蛋白检测方法包括采用流式细胞术。

21、优选地，所述磁珠的表面覆有亲水性聚合物涂层。

22、优选地，所述蛋白检测方法适用于人炎症相关的生物标志物进行分析检测。

23、优选地，所述磁珠选自羧基磁珠。羧基磁珠的表面覆有亲水性聚合物涂层，羧基官能团可用于蛋白的偶联，适合用于对人炎症相关的生物标志物进行分析检测。羧基磁珠具有超顺磁性，在实验中易于磁性分离和再混匀，与本技术提供的封闭剂相适配。

24、优选地，所述磁珠的粒径范围是0.1～0.8μm。如可以为0.1～0.3μm，0.3～0.8μm。

25、优选地，所述人炎症相关的生物标志物包括白细胞介素-8、白细胞介素-6、c反应蛋白、降钙素原、肿瘤坏死因子-α和超敏c反应蛋白中的一种或多种。更优选为白细胞介素-8。

26、本发明技术方案提供的用于基于双抗夹心法蛋白检测中捕获抗体磁珠的封闭剂在用于人炎症相关的生物标志物进行分析检测时，封闭效果好，应用检测时荧光信号值高、灵敏度好。此外，本发明提供的封闭剂成本低、操作简单、性质稳定。