一种利用芯片与纳米粒子结合的三明治结构对呼吸道六种病毒进行SERS特异性检测的方法

本发明属于化学检测领域，尤其针对呼吸道的特异性检测，具体地，涉及一种基于芯片与纳米粒子结合的三明治结构的制备技术，其作用是对呼吸道六种病毒的sers特异性检测。

背景技术：

1、拉曼散射，是光通过介质时由于入射光与分子运动相互作用而引起的频率发生变化的散射,表面增强拉曼，是非侵入性，高灵敏度和特异性，自发荧光和组织干扰小，窄峰宽，实现生物标志物的多重检测，光谱方法似乎是一个很有前途的选择，因为它们快速，适用于现场，并且可以获得有关感兴趣样本的丰富信息。拉曼光谱在探测分子结构方面具有很高的特异性。它通常被认为是根据物质的特征光谱来识别物质的有价值的工具。我们制备了一种新型平台，该平台实现了五种病毒抗原的平行、准确和敏感检测。首先采用银纳米颗粒作为核心材料，在核心表面沉积金层作为外壳，将内部金核进行腐蚀，得到金壳，实现放大并实现可重复的拉曼信号读出的目的，以促进准确的检测。

2、芯片基于金微电极阵列作为具有电流体动力学的反射镜，以操纵流体流动并增强分子相互作用，从而改善生物传感响应。病毒抗原的存在将基于纳米盒的壳纳米结构结合在金微电极上，并产生具有极强“热点”的纳米腔。

3、呼吸道病毒是全球死亡率最高的病毒，包括新型冠状病毒，呼吸道合胞病毒，甲型流感病毒，乙型流感病毒，肺支原体和肺衣原体。通常，病毒性呼吸道感染具有相似的临床表现(例如，发烧、咳嗽和疲劳)，这使得很难开处方。此外，多种病毒的共同传播，特别是在流感季节，给公共卫生带来了更多挑战，因为病毒的共同感染可能使症状复杂化并增加发病率/死亡率。特别是，多病毒合并感染更容易引发过度的免疫反应(如细胞因子风暴)，以抵御病毒入侵，从而导致过度炎症和致命/严重疾病。我们的目标是开发一种策略，允许使便携式拉曼光谱检测呼吸道六种病毒，即不需要等离子体活性sers底物。为了大大降低仅根据拉曼特征识别病毒的难度，我们在样品制备过程中实施了特定的捕获探针，因此最终只需要通过拉曼光谱验证病毒颗粒的存在。对于样品制备，我们建立了一种基于芯片的检测方法，芯片可以高度特异性的病毒结合。芯片方便，易于操作，技术要求最低，可确保如果存在特异性病毒，从而检测到。

技术实现思路

1、针对目前检测方法存在的问题，本发明提供了利用芯片与纳米粒子结合的三明治结构对呼吸道六种病毒进行sers特异性检测的方法。利用纳米空腔增强信号分子的能力，并介绍了一种与芯片结合成三明治结构的样品的制备方案，用于实现呼吸道六种阳性和阴性样品的拉曼光谱鉴别。这些金微电级被受体蛋白功能化，该受体蛋白被用作识别元件，选择性地在芯片表面连接病原体。随后的拉曼检测可以直接区分呼吸道六项阳性和阴性样品。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明提供一种au@reporter纳米壳结构，其特征在于具有包括是以病毒抗体的结合了基于纳米颗粒的壳纳米结构上，并产生了具有局域场增强效应极强“热点”的纳米空腔，有利于敏感分析。

4、进一步的，根据如权利要求1所述au@reporter纳米壳结构，其特征在于以银纳米球作为核心材料，在核心表面沉积金层作为外壳，放大并实现可重复的拉曼信号读出，以促进准确的检测。

5、本发明提供一种au@reporter纳米壳的合成方法具体包括以下：

6、(a)制备银纳米球颗粒；，

7、(b)逐步向产物中加入1μl 50mm氯金酸溶液，1～3μl 10mm reporter，3μl氨水，打匀搅拌20～30min，得到ag@reporter@au纳米标签。

8、(c)如b所述的ag@reporter@au纳米粒子，加入10～15μl 5mm氯金酸溶液，孵育1～3h。得到au@reporter纳米壳结构。

9、进一步的，所述制备银纳米球颗粒的具体步骤为：称取7～8mg硝酸银，24～30mg左右柠檬酸钠，放入管中，分别配置1％浓度的硝酸银溶液和1％浓度的柠檬酸钠溶液。取75～80ml新鲜的超纯水于干净的瓶内，放在磁力搅拌器上，待磁转子均匀稳定旋转后，放入20～30ml的柠檬酸钠，加热至90℃，反应15～20min，到时间后加入1.7～3ml的硝酸银溶液，并快速加入2～4ml新鲜配制的nabh4。反应1h，取下，放置室温并冷却。再补充dd水至溶液到100ml，进行储存。

10、本发明提供一种芯片的应用，其特征在于：使用芯片与如权利要求1-4所述纳米壳粒子结合的三明治结构对心肌炎的sers特异性进行检测。有着在分析过程中具有操作简便，测定时间短，灵敏度高等优点。

11、进一步的，所述芯片与纳米壳粒子结合的三明治结构应用于呼吸道六项病原体的检测。

12、进一步的，芯片与纳米壳粒子结合的三明治结构应用于呼吸道六种病毒所述的检测方法为：加了病人样本的芯片，可以通过拉曼检测，显示出明显的信号，而未加入病人样本的芯片，并未有明显的信号。

13、进一步的，所述呼吸道六种病毒包括新型冠状病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒，肺支原体和肺衣原体。

14、进一步的，基于芯片与纳米粒子结合的三明治结构组装以及对呼吸道六种病毒的特异性检测，由下列步骤组成：(1)加入50～70ul 1％ bsa于电极上，清洗3次。每个电极加入50～70ul样品，将芯片接入200mv，1000hz，通电45min。

15、(2)用50～70ul 1％ bsa清洗三次，放冰箱储存等待测试加入50～70ul1％bsa于电极上，清洗3次。每个电极加入50～70ul样品，将芯片接入200mv，1000hz，通电45min。

16、(3)再用50～70ul 1％的bsa清洗电极三次，移液3-5次。加入20ul sers探针，通电1000hz，200mv，孵育20～30min。

17、(4)用50～70ul 1％bsa清洗三次，放冰箱储存等待测试。

18、本发明提供一种芯片与纳米粒子结合的三明治结构的制备，其方法在于：

19、(a)取20μl 5mm溶于dmso的dsp，加入至芯片的圆形电极中，清洗后加入抗体孵育。孵育后加入对应的病原体，此为功能化的芯片。

20、(b)取功能化后的芯片与同样功能化的纳米粒子结合，测其信号。

21、进一步的，所述的孵育条件，一般是在室温条件下进行。

22、本发明提供一种au@reporter纳米标签的制备方法，其特征如下，该方法由下列步骤组成：

23、(1)在75～80ml水中加入20～30ml的na3ct,在90℃的条件下加热15～20min。

24、(2)将1.7～3ml的agno3(1％)添加到上述溶液中，然后快速加入2～4ml新鲜制备的nabh4(0.1％)。继续搅拌1h，并冷却至室温，加入额外的h2o，使总体积达到100ml。

25、芯片的功能化，由下列步骤组成：将20～30ul 5mm溶于dmso的dsp加入到圆形电极，室温下孵育30～60min，再用50ul无水醇清和pbs清洗。清洗后加入30～40ul 10ug/ml的抗体，孵育过夜。

26、本发明提供一种au@reporter纳米标签功能化的方法，其特征如下，该方法由下列步骤组成：

27、(1)取200～300μl au@reporter@au纳米标签，加入10～15μl 1mm mua溶液，在25℃，450rpm的条件下孵育6-8h。

28、(2)取(1)的产物，加入10～15μl 20mm sulfo-nhs和10～15μl 10mm edc，在25℃450rpm条件孵育30～60min，孵育后离心，用200μl ph＝7.4浓度为10mm的pb重悬。

29、(3)加入0.5μl～1μl抗体于(2)的产物，在25℃450rpm条件下孵育30min，离心重悬于200μl 0.1％ bsa pb溶液。

30、本发明所制备的au@reporter纳米壳结构是一种纳米材料的设计，其中"au"代表金(金的化学符号)，"reporter"代表探针或标记物。这种结构通常由金属纳米粒子核心和外层包覆的壳层组成。au@reporter纳米壳结构的核心通常是金属纳米粒子，其尺寸通常在几纳米到几十纳米的范围内。金属纳米粒子具有许多独特的物理和化学性质，如表面增强拉曼散射(surface-enhanced raman scattering，sers)效应和局域表面等离子共振(localized surface plasmon resonance，lspr)效应。为了增加核心纳米粒子的稳定性和功能性，au@reporter纳米壳结构在核心表面形成了一层外壳。这层外壳可以是一种金属、合金、半导体材料或有机物，具体取决于应用需求。外壳的选择可以调节核心粒子的光学、电学、磁学和化学性质，同时还可以提供额外的化学官能团，用于与其他分子或材料之间的反应。au@reporter纳米壳结构在生物医学、传感器、光学和催化等领域具有广泛的应用。例如，在生物医学中，au@reporter纳米壳结构可用于生物标记、药物传递和光热疗法。在传感器领域，它们可用于检测环境中的分子、离子或生物分子。此外，au@reporter纳米壳结构还可以用于增强光学传感器的灵敏度和选择性，或者作为催化剂促进化学反应。综上所述，au@reporter纳米壳结构是一种具有金属纳米核心和外层壳层的纳米材料，具有广泛的应用潜力。

31、本技术提供的技术方案可以包括以下有益效果：

32、(1)与传统的检测方法相比，基于芯片与纳米粒子结合的三明治结构对呼吸道六种病毒的sers特异性检测有着在分析过程中具有操作简便，测定时间短，灵敏度高等优点。

33、(2)纳米壳均匀分布在芯片上，大大增加与样本中待测物接触面积，减少反应所需的样本量。

34、(3)与传统纳米粒子相比，该三明治结构所用的au@reporter纳米壳具有比常用的球形纳米结构更强的电磁场，利用纳米粒子的独特光学性质，如表面等离子体共振效应，来放大病毒抗原的信号，能更好的增强分子的信号的能力，使得检测更为敏感和准确。

35、(4)与采用相同具有类检测的方法相比，本发明所使用的芯片可以均匀连接对应抗原，大大增加与样本中待测物接触面积，减少反应应所需的样本量，同时更快达到反应动态平衡，加快反应速度，节省反应时间。

36、(5)本发明所述芯片与纳米粒子结合的三明治结构，可以并行测量多种病毒。特别是一次检测多种病毒的能力，提高了效率，减少了患者的不适感。

37、(6)使用的手持编写式拉曼光谱仪高分辨率、现场便携性,以及实验室分析级性能的理想融合。便携式拉曼光谱仪可在任何地方提供灵活的采样方式与高质量的分析结果。