一种用于CK（Pan）/BRG1套染的试剂盒及其应用

本发明属于免疫组化，具体涉及一种用于ck（pan）/brg1套染的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、胸部smarca4缺失性未分化肿瘤（thoracic smarca4-deficientundifferentiated tumor, smarca4-ut）是新版who肿瘤（2021年版）胸部肿瘤分类标准(the fifth edition of the 2021 world healthorganization (who) classificationof thoracic tumors)中新增的一种罕见且高度侵袭性的恶性肿瘤，主要发生于成人胸部（包括肺及纵隔等），组织学形态以实性结构为主，伴或不伴坏死，肿瘤细胞呈上皮样形态、以未分化形态或横纹肌样形态为主，部分肿瘤细胞粘附性差或失粘附，伴有brg1蛋白缺失表达，上皮免疫标记物（如ck（pan））呈阴性表达。

2、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，nsclc)是除小细胞肺癌（sclc）以外，所有来源于肺上皮的各种类型癌症的集合体，其中也存在smarca4异常的类型，据文献报道，smarca4在非小细胞肺癌患者中突变率约4-11%，低分化非小细胞癌中smarca4突变率更高。smarca4缺失性非小细胞肺癌常具有经典非小细胞肺癌的区域以及实性区域，也可伴有横纹肌样形态。

3、胸部smarca4缺失性未分化肿瘤和smarca4缺失性非小细胞肺癌都属于smarca4缺失性肿瘤这一类恶性肿瘤，均伴有brg1蛋白缺失表达。当低分化非小细胞癌呈实性结构为主的时候，很难从组织，尤其是穿刺或活检小组织的病理学形态鉴别其是否为smarca4缺失性非小细胞肺癌；当smarca4缺失性非小细胞肺癌的上皮结构（如腺泡结构、乳头结构、微乳头结构、筛状结构及复杂腺体、角化等）不典型的时候，其组织病理学形态和smarca4缺失性未分化肿瘤极其相似，这对胸部smarca4缺失性未分化肿瘤和smarca4缺失性非小细胞癌进行鉴别诊断有时候也极其困难，需要借助免疫组化染色协助诊断。因此，本领域极其需要免疫组织化学染色等其他工具来提高诊断灵敏度和准确性，以避免smarca4缺失性肿瘤因缺乏特异性分化被误诊，以及smarca4缺失性肿瘤中smarca4缺失性非小细胞癌和胸部smarca4缺失性未分化肿瘤诊断发生混淆。

4、目前，大多数smarca4缺失性肿瘤进展迅速，诊断时分期较晚，往往错过了手术机会，预后较差。因此，在进行病理诊断时，大部分患者通常通过活检或穿刺标本来获取组织样本，并尽可能节约组织用于基因检测。对于晚期恶性肿瘤患者而言，肿瘤组织是非常宝贵的资源。因此，有效利用穿刺标本或活检标本至关重要。日常病理诊断中，经常需要做多种免疫组化检测协助分析。但由于技术的限制，常用的免疫组化方法是在1张病理组织玻片上用一种颜色（一般为棕色）标记一种蛋白。当分析多种蛋白指标时，需要用对应的抗体分别在多张不同的玻片上标记。这样的单一标记的免疫组化染色方法，缺点如下：①每一个标记需要一张组织切片，标本浪费；②分别染色在两个玻片上的两个免疫组化指标是否同时表达于同一群细胞，靠经验和推测，需要反复对比he及免疫组化切片，阅片难度大。没有经验的病理医师常无法准确诊断smarca4缺失性肿瘤，更易将smarca4缺失的非小细胞癌诊断为胸部smarca4缺失性未分化肿瘤，从而导致误诊，进而影响临床诊疗方案。

5、多色免疫组化能在一张切片上观察多个抗原的染色结果，不同抗原之间的关系对比直接，有利于节省组织与肿瘤蛋白表达情况的观察。现多色免疫组化技术已经应用到前列腺、乳腺、消化道等多种疾病的病理诊断中，技术难点在于找到合适的两种或多种合适的标记物以使用一抗和二抗共同标记在同一组织切片上，以达到颜色对比鲜明，定位准确的效果。因此，目前还没有通过多色免疫组化用于胸部smarca4缺失性肿瘤诊断，特别是smarca4缺失性非小细胞癌与胸部smarca4缺失性未分化肿瘤的鉴别诊断，为临床治疗和预后判断提供重要信息。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是胸部未分化肿瘤难以快速准确诊断的技术问题。

2、本发明首先提供了一种用于ck（pan）/brg1套染的试剂盒，包括一抗试剂、二抗试剂；所述一抗试剂包括ck（pan）抗体和brg1抗体；所述二抗试剂包括组合二抗（hrp标记抗小鼠igg/hrp+兔抗igg/ap）或组合二抗（hrp标记抗小鼠igg/ap+兔抗igg/hrp），所述二抗试剂包括ck（pan）二抗和brg1二抗。

3、其中，所述ck（pan）抗体和brg1抗体来源于两种不同种属的动物。进一步的，两种不同种属的动物分别为鼠或兔。

4、其中，所述染色剂为过氧化物酶hrp 辣根介导的染色剂和碱性磷酸酶（ap）介导的染色剂。

5、其中，所述一抗试剂和二抗试剂中的针对同一抗原的抗体来源相匹配。进一步的，所述ck（pan）抗体来源于鼠或兔，brg1抗体来源于兔或鼠，ck（pan）抗体和brg1抗体来源动物不同。

6、进一步的，上述二抗试剂含有与上述一抗试剂中的ck（pan）或brg1抗体种属来源相匹配的辣根过氧化物酶（hrp）标记的二抗聚合物；上述二抗试剂含有与上述一抗试剂中的ck（pan）或brg1抗体种属来源相匹配的碱性磷酸酶（ap）标记的二抗聚合物；所述二抗试剂中的ck（pan）二抗和brg1二抗的标记不同。

7、比如，上述二抗试剂包括组合二抗（hrp标记抗小鼠igg/hrp+兔抗igg/ap）或组合二抗（hrp标记抗小鼠igg/ap+兔抗igg/hrp）。

8、其中，上述试剂盒中还包括染色剂，所述染色剂包括辣根过氧化物酶底物染色液和碱性磷酸酶底物染色液。

9、其中，上述辣根过氧化物酶底物染色液包括3,3-二氨基联苯胺盐酸盐（dab）；或者所述碱性磷酸酶底物染色液包括红色碱性磷酸酶底物，所述红色碱性磷酸酶底物染色液包括fast red a和fast red b。

10、进一步的，上述染色剂还包括复染染色液，所述复染染色液的显色不掩盖所述辣根过氧化物酶底物染色液和碱性磷酸酶底物染色液的显色。

11、其中，上述的双染免疫组化试剂盒中还含有抗原修复剂和/内源性过氧化氢酶封闭试剂。

12、进一步的，上述双重免疫组化染色试剂盒用于对组织切片进行染色。进一步的，所述的组织切片为人体石蜡组织切片和人体冰冻组织切片。

13、可以理解的是上述试剂盒中的各种试剂为独立包装。

14、本发明还进一步地提供了前述试剂盒在制备鉴别胸部smarca4缺失性未分化肿瘤和smarca4缺失性非小细胞癌中的应用。

15、本发明还在上述方案基础上提供了一种胸部肿瘤组织切片进行双重免疫组化染色的方法。该方法其特征在于包括以下步骤三种操作方式：

16、a：

17、(1) 准备组织切片，进行抗原修复、内源性过氧化氢酶封闭；

18、(2)使用一抗试剂对组织切片进行孵育：采用鸡尾酒一抗，该鸡尾酒一抗包含鼠来源ck（pan）一抗和兔来源brg1一抗，或者包括兔来源ck（pan）一抗和鼠来源brg1一抗；

19、（3）二抗孵育与显色反应：先使用与ck（pan）或brg1抗体种属来源相匹配的辣根过氧化物酶（hrp）标记二抗进行孵育，介导3,3-二氨基联苯胺盐酸盐（dab）反应，产生不溶于水和乙醇的棕黄色或棕褐色沉淀；再进行与剩余的brg1或ck（pan）抗体种属来源相匹配的碱性磷酸酶（ap）标记二抗进行孵育介导红色底物显色系统染色；

20、（4）切片复染；保存备用。

21、根据酶标二抗不同可呈现不同的结果：

22、hrp标记二抗与ck（pan）结合/ap标记二抗与brg1结合：ck（pan）棕色细胞质染色和brg1红色细胞核染色；

23、hrp标记二抗与brg1结合/ap标记二抗与ck（pan）结合：brg1棕色细胞核染色和ck（pan）红色细胞质染色。

24、或者b：

25、（1）准备组织切片，进行抗原修复、内源性过氧化氢酶封闭；

26、（2）使用一抗试剂对组织切片进行孵育：采用鸡尾酒一抗，该鸡尾酒一抗包含鼠来源ck（pan）一抗和兔来源brg1一抗，或者包括兔来源ck（pan）一抗和鼠来源brg1一抗；

27、（3）二抗孵育与显色反应：采用鸡尾酒二抗，同时介导酶促显色反应；该鸡尾酒二抗包含分别针对ck（pan）或brg1的辣根过氧化物酶（hrp）标记二抗和碱性磷酸酶（ap）标记二抗，并与对应的一抗的种属来源相匹配； hrp介导生成棕黄色或棕褐色沉淀，ap介导生成红色沉淀；

28、（4）切片复染；保存备用。

29、根据酶标二抗不同可呈现不同的结果：

30、hrp标记二抗与ck（pan）结合/ap标记二抗与brg1结合：ck（pan）棕色细胞核染色和brg1红色细胞质染色；

31、hrp标记二抗与brg1结合/ap标记二抗与ck（pan）结合：brg1棕色细胞核染色和ck（pan）红色细胞质染色。

32、或者c：

33、（1）准备组织切片，进行抗原修复、内源性过氧化氢酶封闭；

34、（2）使用鼠或兔来源ck（pan）或brg1一抗孵育，使用与一抗种属来源相匹配的辣根过氧化物酶（hrp）标记二抗进行孵育，介导3,3-二氨基联苯胺盐酸盐（dab）反应，产生不溶于水和乙醇的棕黄色或棕褐色沉淀；

35、（3）二抗孵育与显色反应：然后与用前述一抗来源不同且针对的抗原不同的，鼠或兔来源的brg1或ck（pan）的一抗进行孵育；孵育后用与一抗种属来源相同的碱性磷酸酶（ap）标记二抗进行孵育，介导基于ap催化的fast red a和fast red b生成红色沉淀；

36、（4）复染；保存备用。

37、根据一抗选择先后顺序呈现不同的结果：

38、步骤一选择ck（pan）/步骤二选择brg1：ck（pan）棕色细胞质染色和brg1红色细胞核染色；

39、步骤一选择brg1/步骤二选择ck（pan）：brg1棕色细胞核染色和ck（pan）红色细胞质染色。

40、使用该方法制备的双重染色切片，可用于进行显微观察，以对胸部smarca4缺失性未分化肿瘤和smarca4缺失性非小细胞癌进行鉴别诊断。

41、使用该方法制备的双重染色切片，可用于进行显微观察，以鉴别未分化肿瘤。

42、本发明所述“brg1”是位于染色体19q13上的smarca4基因编码的brg1蛋白。

43、本发明所述“ck（pan）”是广谱细胞角蛋白pancytokeratin。

44、本发明所述“fast red a”和“fast red b”是有机染料，cas号分别为6409-77-42、49735-71-9。

45、本发明的有益效果：

46、本发明技术方案利用双重免疫组化技术，针对两个有关联抗原蛋白指标ck（pan）和brg1，brg1免疫组化定位在细胞核，ck（pan）定位在细胞质，在一张切片上能同时对同一个肿瘤细胞中两种免疫组化的表达情况，从而有助于正确的病理诊断，能帮助快速识别并诊断胸部smarca4缺失性肿瘤，在肺部肿瘤中， ck（pan）(阳性)/brg1(缺失)提示为smarca4缺失性非小细胞癌，ck（pan）(阴性)/brg1(缺失)提示为胸部smarca4缺失性未分化肿瘤。利用本发明技术方案，使得同时标记的两个抗原指标是否同时表达于同一群细胞变得所见即所得，直接以显微镜下观察的结果做判断，而不再靠经验和推测做判断，降低了阅片难度，提高了工作效率及判断准确性，达到了“1+1>2”的效果。另一方面，由于一张玻片可以同时检测两个蛋白指标，也减少了组织切片的使用量，具有好的技术效果。本发明技术方案经临床实验，证实在鉴别胸部smarca4缺失性未分化肿瘤和smarca4缺失性非小细胞癌发挥重要作用，本技术方案的发明可以为提高诊断灵敏度和准确性有较好的应用前景。