一种快速富集N-乙酰葡萄糖胺修饰的肽段的方法

本发明属于蛋白质富集，尤其是涉及一种快速富集n-乙酰葡萄糖胺修饰的肽段的方法。

背景技术：

1、o-连接的β-d-n-乙酰氨基葡萄糖(o-glcnac)是最常见的糖基化修饰，可调节从转录和翻译到信号转导和新陈代谢等基本细胞过程。o-glcnac由两种酶控制，即o-glcnac转移酶(ogt)和o-glcnac酶(oga)，分别介导蛋白质中o-glcnac的添加和去除，以控制o-glcnacylation的动态循环。与磷酸化相似，蛋白上o-glcnac的可逆修饰会影响蛋白质的功能，并使其在生物过程中发挥重要的作用。在生理学上，越来越多的证据表明，o-glcnac平衡失调与糖尿病、神经退行性疾病和癌症等多种人类疾病的发病机制有关。因此，发现和鉴定o-glcnacylation以了解其在细胞生理和疾病中的功能一直是研究热点。

2、由于o-glcnacylation的丰度较低，且生物样本较为复杂，因此有必要在液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)分析o-glcnacylation之前开发富集方法。到目前为止，已经开发出一系列商业富集材料，如抗体、凝集素和亲水作用液相色谱(hilic)。它们依靠材料与o-glcnac糖基部分之间的亲和力进行富集，能保留完整的o-glcnac分子，操作简便，但存在结合亲和力弱、特异性有限等问题。与此同时，还开发了基于共价作用的富集方法，如化学衍生酰肼化学法和dtt迈克尔加成法(bemad)。这些方法依赖于共价键的形成来富集，但存在反应效率低或假阳性鉴定等问题，这可能会限制它们的应用普及以及用于在全球范围内对o-glcnac蛋白进行大规模表征。

3、近年来，woo等人和qin等人开发了可裂解生物素-链霉素亲和富集策略，用于捕获和鉴定体外和细胞中的o-glcnac蛋白。通过化学酶法或代谢标记法在o-glcnac分子中引入生物正交基团后，糖蛋白被生物素标记，然后被链霉素琼脂糖珠捕获，随后在紫外线或酸性条件下释放。与上述方法(凝集素、bemad等)相比，这种策略可以提高糖肽富集的效率。可裂解生物素-链霉素亲和富集方法虽然很流行，但流程较为复杂，因为除了生物素标记、捕获和释放三个步骤外，还需要甲醇-氯仿沉淀步骤去除多余的生物素，以免干扰后续的亲和富集步骤。同时，该方法是在蛋白质水平上将生物素标记到o-glcnac分子上，可能会影响生物素标记的效率(蛋白质复杂的高级结构导致的空间位阻)和糖基化位点的全面覆盖(识别到的位点更可能是暴露在蛋白质表面的位点)。

4、中国专利cn116735726a公开了一种基于可逆化学酶促标记-亲水作用色谱富集的o-glcnac糖肽富集方法。具体涉及：基于endo-m等糖苷内切酶的突变体的转糖活性进行o-glcnac糖肽的化学酶促标记，将带有噁唑啉结构的n-糖链整体转接到o-glcnac糖基上，然后利用亲水作用色谱对标记的o-glcnac糖肽进行一步富集。针对富集获得的引入n-糖链结构的o-glcnac糖肽，利用野生型糖苷内切酶将标记糖链切除，实现o-glcnac糖肽的无痕富集。该方案中，亲水作用液相色谱依靠材料与o-glcnac糖基部分之间的亲和力进行富集，存在结合亲和力弱、特异性有限等问题。

5、中国专利cn114371297a公开了一种固相富集结合串联酶切标签的富集新生蛋白质的方法，用aha标记细胞后提取全蛋白；取细胞裂解液和炔基树脂通过click反应连接，用不同的缓冲液洗涤炔基树脂上非特异吸附的蛋白；用胰蛋白酶和tev酶顺次酶切释放肽段，收集样品进行lc-ms/ms分析；所述炔基树脂为将炔基肽段ggtenlyfqg(l-apra)与醛基树脂通过还原烷基化反应连接得到的炔基树脂，所述炔基肽段中，enlyfqg序列是tev酶识别的序列，q和g之间是酶切的位点，酶切后g(l-apra)作为可裂解标签tc-tag共价键连接在aha肽段上，用于质谱鉴定和肽段指认。该方案实现了新生蛋白质的高效富集，质量标签质谱兼容且帮助鉴定和指认新生蛋白质。此外，整个富集流程得到极大简化，降低了样本需要量。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种快速富集n-乙酰葡萄糖胺修饰的肽段的方法。也可称之为快速富集o-glcnac肽段的方法。

2、本发明采用固相富集结合酶切标签的o-glcnac肽段的方法，glcnac-tc(glcnacenrichment based on phase-solid capture and trypsin cleavage)，用于o-glcnac肽段的富集和鉴定。

3、本发明设计并合成了由炔基肽段和树脂材料制备而成的炔基树脂，作为功能化固相材料，用于富集由代谢标记产生的含叠氮基团的o-glcnac糖肽，该功能化固相材料结构稳定、富集容量高、分离方便可靠。

4、本发明通过固相共价富集o-glcnac糖肽结合高效酶切释放标记糖肽，提供一种富集o-glcnac糖肽的新方法，富集后肽段加上质量小标签(tc-tag，112.13da)与质谱兼容且帮助鉴定和指认o-glcnac糖肽，实现o-glcnac糖肽的富集、鉴定、定量同时指认。整个富集流程得到极大简化，操作方便，大大降低样本起始量。

5、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

6、本发明提供一种快速富集n-乙酰葡萄糖胺修饰的肽段的方法，具体步骤包括：

7、1)用galnaz标记细胞，收集细胞悬液；

8、2)提取细胞核蛋白并酶解，得到蛋白酶解产物；

9、3)cuaac反应：蛋白酶解产物与炔基树脂通过click反应连接；

10、4)固相洗涤非特异性肽段：用不同的缓冲液洗涤炔基树脂上非特异吸附肽段；

11、5)酶切释放肽段；

12、6)收集样品进行lc-ms/ms分析。

13、在本发明的一个实施方式中，步骤1)中，用galnaz标记细胞的方法为：

14、用galnaz(四酰化n-叠氮基乙酰基氨基半乳糖)培养hela细胞，收集细胞。具体步骤：当细胞生长到50％-60％时，用含有500μm的galnaz的标记全培养基(dulbecco'smodified eagle medium，dmem)培养48h，收集细胞悬液。

15、在本发明的一个实施方式中，步骤2)中，提取细胞核蛋白需要分离细胞悬液中的细胞核，细胞核的分离按照现有技术进行(nature communications,2021,12,7113)。

16、在本发明的一个实施方式中，步骤2)中，提取细胞核蛋白的方法如下：

17、首先将细胞悬液中的细胞重悬于含有digitonin和tween-20的as缓冲液中；细胞悬浮液混悬，冰上孵育，离心，回收上清液标记为细胞质部分，然后用as缓冲液洗涤细胞颗粒，并重新悬浮在含十二烷基麦芽糖苷的ag缓冲液中，样品在冰上旋转，回收细胞颗粒，然后用ag缓冲液洗涤细胞颗粒，并将其重悬于含sds的细胞核分离缓冲液中，样品在冰上孵育并超声，上清液收集为核组分，离心，取上清，即为细胞核蛋白。

18、在本发明的一个实施方式中，步骤2)中，提取细胞核蛋白的方法具体如下：

19、首先将细胞悬液中的细胞重悬于含有0.015wt％digitonin(sigma-aldrich)和0.5wt％tween-20的as缓冲液中；细胞悬浮液混悬5次，冰上孵育35min，500g离心3min，回收上清液标记为细胞质部分，然后用1ml as缓冲液洗涤细胞颗粒，并重新悬浮在含1wt％十二烷基麦芽糖苷的ag缓冲液中，样品在冰上旋转15min，然后以500g转速旋转3min，回收细胞颗粒，然后用500μl ag缓冲液洗涤细胞颗粒，并将其重悬于含0.2wt％sds(十二烷基硫酸钠)的细胞核分离缓冲液中，样品在冰上孵育1h并超声3min，上清液收集为核组分，在4℃下以18,000g离心10min，取上清，即为细胞核蛋白。

20、在本发明的一个实施方式中，步骤2)中，核蛋白酶解的方法为：细胞核蛋白在75℃下加热15min后，用胰蛋白酶在37℃下消化过夜，并在-80℃下保存，得到蛋白酶解产物。

21、在本发明的一个实施方式中，所述as缓冲液的组成为30mm hepes，ph＝7.4，15mmnacl，350mm蔗糖，20μm thiamet-g(sigma-aldrich)，1片/10ml不含edta的蛋白酶抑制剂。

22、在本发明的一个实施方式中，所述ag缓冲液的组成为30mm hepes，ph＝7.4，15mmnacl，20％(体积分数)甘油，20μm thiamet-g。

23、在本发明的一个实施方式中，所述细胞核分离缓冲液的组成为：30mm hepes，ph＝7.4，500mm nacl，20μm thiamet-g，1片/10ml不含edta的蛋白酶抑制剂。

24、在本发明的一个实施方式中，步骤3)中所述炔基树脂通过以下方法制备得到：

25、将合成的炔基肽段ggtenlyfqg(l-apra)与醛基树脂通过还原烷基化反应连接，合成得到功能化的炔基树脂。

26、其中，炔基肽段为ggtenlyfqg(l-apra)，含有trypsin酶切的特异性识别位点，以及氨基酸短链linker，其中炔基氨基酸的羧基末端通过酰胺化反应，封闭自由羧基，防止富集过程中可能发生的副反应。该肽段序列enlyfq是tev酶识别的序列，q和g之间是酶切的位点，酶切后g(l-apra)作为可裂解标签tc-tag共价键来连接在aha肽段上，质量增加169.09da，用于质谱鉴定和肽段指认。

27、在本发明的一个实施方式中，所述醛基树脂为可用还原胺化连接的醛基功能化树脂材料(aminolink aldehyde-functionalized resin,pierce)，可以选自商品化醛基树脂(thermo-coupling resin)。

28、在本发明的一个实施方式中，所述炔基树脂通过以下方法制备得到：

29、炔基肽段ggtenlyfqg(l-apra)与醛基树脂的偶联：炔基肽段ggtenlyfqg(l-apra)、醛基树脂、还原试剂在pbs中室温反应；

30、然后用偶联试剂洗涤；

31、封闭剩余活性基团：加终止试剂，室温反应；

32、洗涤炔基树脂：洗涤多次，得到炔基树脂，保存备用。

33、在本发明的一个实施方式中，所述偶联试剂选自含有0.1m na3po4，0.15mnacl，ph7.2的pbs。

34、其中，所述还原试剂选自50mm nabh3cn。

35、其中，所述终止试剂选自50mm nabh3cn和1m trist-hcl(ph7.4)。

36、其中，所述洗涤试剂为1m nacl和pbs。

37、在本发明的一个具体实施方式中，炔基树脂的制备方法为：将20μg炔基肽段ggtenlyfqg(l-apra)与10μl醛基树脂于pbs中偶联，还原试剂为50mm nabh3cn，在室温反应6h；用偶联试剂(含有0.1m na3po4，0.15m nacl，ph 7.2的pbs)洗涤3次；加50mm nabh3cn于tris-hcl buffer(1m,ph 7.4)，室温反应30min，封闭剩余活性基团；用1m nacl和pbs洗涤炔基树脂，重悬于pbs中4℃保存备用。

38、本发明中，所述炔基树脂是由含有一条作为linker的炔基肽段ggtenlyfqg(l-apra)与醛基树脂通过还原烷基化反应连接得到的，linker部分在胰蛋白酶酶切后产生裂解标签tc-tag共价键连接在糖肽的glcnac部分上，可用于质谱鉴定和肽段指认。

39、在本发明的一个实施方式中，步骤3)中，蛋白酶解产物与炔基树脂通过click反应连接的具体方法为：

40、蛋白酶解产物和炔基树脂混合后加入10×click工作液，用dpbs补足反应体系，此时为sds应该低于0.05％，放暗处，在室温振荡反应1h。

41、在本发明的一个实施方式中，所述click工作液的组成为：1mm硫酸铜，5～6mmbttp，10mm抗坏血酸。

42、在本发明的一个实施方式中，蛋白酶解物、炔基树脂、10×click工作液的比例为500μg：10μl：50μl，用dpbs补足反应体系至500μl，可以根据需要按照此比例放大反应量。

43、在本发明的一个实施方式中，步骤4)中，固相洗涤非特异性肽段的方法为：

44、用1wt％sds洗涤液，8m尿素，50％(体积分数)乙腈和50mm碳酸氢铵溶液，依次洗涤，每次用1ml洗涤3次，每次5min；

45、其中1wt％sds洗涤液成分为：1wt％sds，100mm tris-hcl，5mm edta。

46、在本发明的一个实施方式中，步骤5)中，酶切释放肽段的方法为：

47、将经过洗涤的20μl树脂混悬在200μl的50mm碳酸氢铵溶液中，加胰蛋白酶2μg酶切，37℃酶切过夜释放非标记肽段。

48、在本发明的一个实施方式中，步骤6)中，收集样品进行lc-ms/ms分析后得到trypsin dataset(基于胰蛋白酶酶切后的肽段，获得的质谱数据)。质谱分析数据获得o-glcnac糖肽和糖蛋白的鉴定和指认结果。

49、本技术方案设计并合成了一种炔基功能化的树脂材料，可直接通过点击化学反应高效富集代谢标记上叠氮的o-glcnac糖肽，将传统的衍生-富集一体化，实现一步富集；该材料携带含胰蛋白酶切位点的linker，可以通过胰蛋白酶酶切释放富集到的糖肽，且会给糖肽的糖单元带上小质量标签(小分子量的氨基酸)，从而在串级碎裂中产生带有特定的质量标签的氧鎓离子，更有利于o-glcnac糖肽和糖蛋白的指认。本技术方案将树脂材料与代谢标记相结合，发展了一种通过固相共价一步富集糖肽的方法，利用高效酶切释放标记糖肽，实现了o-glcnac糖肽的高效富集，质量标签质谱兼容且帮助鉴定和指认o-glcnac糖肽和糖蛋白。此外，整个富集流程得到极大简化，降低了样本需要量。该方案富集的对象为新生蛋白质，其实现的效果也是借助标签的质量增加直接指认新生蛋白质，能够验证新生蛋白质。

50、本发明方法通过一步标记-衍生实现了对o-glcnac肽段的高效富集，可以实现富集、鉴定、定量，同时验证细胞中o-glcnac蛋白质。整个富集流程得到极大简化，且带上的标签质谱兼容，产生特定质量的氧鎓离子能帮助鉴定和指认o-glcnac糖肽。此外，对于o-glcnac这种低丰度修饰而言，该方法大大减少了富集过程中的样品损失，降低了需要的样品起始量。

51、具体地，与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下方面：

52、1.基于click反应的生物正交性和蛋白酶的选择性，保证了该方法的富集特异性，且能够将tc-tag标记糖单元glcnac上，使得串级谱图中有大量带特定质量标签的氧鎓离子可用于指认o-glcnac糖肽。此外该方法在肽段层面对o-glcnac糖肽富集，实现了对糖基化位点的深度覆盖，从三次生物重复中共鉴定出354个蛋白上的1616个糖基化位点，且对鉴定多位点糖肽具有优势，约有超过四分之一的糖肽具有多个(>2)糖基化位点。

53、2.固相共价键合，凭借化学键合比亲和作用更加可靠牢固，允许严苛的洗涤，提高富集选择性的同时不影响回收率，使得鉴定的灵敏度得到极大提升。样本起始量从常规的最少2mg的细胞蛋白，减少到0.5mg起始量，经过富集后一维色谱分离，单次平均鉴定到约290个o-glcnac蛋白上的900多个糖基化位点。文献报道glcnac-cho方法1.8mg起始量，经过两维分离，鉴定的蛋白也只有260个(2021ac)。

54、3.本方法通过固相click反应实现一步捕获o-glcnac肽段，极大简化了富集步骤。生物素法中蛋白质首先要通过click反应将炔基生物素修饰到蛋白上，然后需要蛋白沉淀去除cuaac反应的试剂和多余的炔基生物素，然后亲和连接到固体材料。释放过程同样做了简化，通过酶切释放肽段，便可以兼容lc-ms/ms分离分析。生物素法强烈洗脱肽段后，需要专门去除洗脱试剂，才能和色谱质谱兼容。在操作步骤上的简化，不仅缩短操作时间，更重要的是减少了样品的消耗。该方法可以实现0.5mg的起始样品量，单次实验富集到约290多个新生蛋白和900多个含有tc-tag糖基化位点。