一种血型特异性抗体分型检测试剂盒及其制备方法与流程

本技术涉及生物检测，具体而言涉及一种血型特异性抗体分型检测试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、血型不合新生儿溶血病(hdn)是一种常见于胎儿和新生儿具有溶血表象的自限性免疫性综合病征。主要是由于母婴血型不合所致，主要包括：abo血型系统、rh血型系统和mn血型系统等。高效价igg抗体孕妇血清中的igg抗体亚型与新生儿溶血病的发生及危重程度呈正相关。尤其是igg1或igg3亚型阳性具有较高发生溶血病概率且病情相对较重，须积极进行相应治疗。因此，igg亚型检测在abo、rh和其他血型不合新生儿溶血病的诊治过程中起到重要的作用。但是目前血型特异性抗体检测的主要方法是微柱凝胶法，只能检测总igg，无法对特异性igg进行分型。

技术实现思路

1、为了能够在进行血型特异性抗体检测过程中对特异性igg进行分型，实现半定量检测，本技术提供一种血型特异性抗体分型检测试剂盒及其制备方法。

2、第一方面，本技术提供的一种血型特异性抗体分型检测试剂盒采用如下技术方案：一种血型特异性抗体分型检测试剂盒，所述试剂盒包括圆底微孔板和显色体试剂；

3、所述显色体试剂包括：至少两种不同颜色的微球，所述微球上喷涂有不同亚型的抗人igg亚型抗体；

4、所述圆底微孔板的孔内包被有能够与不同亚型的igg亚型抗体特异性结合的红细胞膜抗原。

5、通过采用上述技术方案：用该检测试剂盒测试时，当待测血液样品中含有血型特异性抗体亚型，血型特异性抗体亚型会与红细胞膜抗原、微球、抗人igg亚型抗体形成微球-抗人igg亚型抗体-血型特异性抗体-红细胞膜抗原复合物，经离心后，微球会平铺在微孔中；若不含血型特异性抗体亚型，则微球会在离心力作用下汇聚微孔底部，观察微孔板底部状态以及颜色变化即可实现对样品中的血型特异性抗体亚型实现半定量检测。

6、优选的，所述不同亚型的抗人igg亚型抗体包括抗人igg1亚型抗体、抗人igg2亚型抗体、抗人igg3亚型抗体、抗人igg4亚型抗体中的至少两种。

7、通过采用上述技术方案：由于采用了针对不同血型特异性抗体亚型的抗人igg亚型抗体，可以准确地检测出待测血液样品中是否存在相应的血型特异性抗体亚型，避免了假阳性和假阴性的出现。

8、第二方面，本技术提供的一种血型特异性抗体分型检测试剂盒的制备方法采用如下技术方案：

9、一种血型特异性抗体分型检测试剂盒的制备方法，包括：

10、制备不同亚型的微球-抗人igg亚型抗体复合物并配制成溶液；

11、在圆底微孔板的微孔内包被抗原a。

12、通过采用上述技术方案：由此制得而成的检测试剂盒能够对对特异性igg进行分型检测。

13、优选的，所述微球-抗人igg亚型抗体复合物的制备方法如下：

14、a1、将微球分散于第一缓冲液中，在涡旋条件下进行活化并加入不同亚型的抗人igg抗体，继续涡旋20-24h，得到用不同抗人igg亚型抗体标记后的微球；

15、a2、将所述用抗人igg亚型抗体标记后的微球离心后分散于第二缓冲液中并超声处理，加入bsa水溶液封闭1-3h，即得微球-抗人igg亚型抗体复合物。

16、通过采用上述技术方案：能够快速高效的制备出微球-抗人igg亚型抗体复合物。

17、优选的，所述微球-抗人igg亚型抗体复合物溶液的配置方法为：向所述微球-抗人igg亚型抗体复合物加入微球稀释液，混匀配置成溶液；

18、优选的，所述微球稀释液包括以下组分：6-10份tris、10-20份蔗糖、5-10份peg6000、5-10份牛血清蛋白、1-3份酪蛋白钠、0.1-0.25份防腐剂；

19、其制备步骤包括：将tris、蔗糖、peg 6000、牛血清蛋白、酪蛋白钠、防腐剂混合，并用纯水溶解，纯水定容后，过滤即得。

20、通过采用上述技术方案：将微球-抗人igg亚型抗体复合物分散至微球稀释液中能够实现对微球-抗人igg亚型抗体复合物进行保护，待使用时提取即可。

21、优选的，所述圆底微孔板的微孔内包被抗原a的方法如下：

22、s1、将红细胞离心后所得的压积红细胞分散至木瓜蛋白酶的pbs溶液中，恒温消化；

23、s2、洗涤消化后的红细胞并溶血，离心得到红细胞膜，洗涤，将红细胞膜加入碳酸盐缓冲液中；

24、s3、对所述碳酸盐缓冲液超声至澄清，加入圆底微孔中，2-8℃包被过夜；

25、s4、舍去包被后微孔孔内的溶液，洗涤并加入bsa溶液2-8℃封闭过夜，舍去封闭液，干燥，即得。

26、通过采用上述技术方案：将抗原a包被在微孔板中，可以确保与不同血型特异性抗体亚型的特异性结合，避免了交叉反应和假阳性的出现，从而显著提高了检测的特异性，其次，通过微孔板中的包被技术，抗原a与待测血液样品的接触面积得以增加，这不仅提高了检测的灵敏度，还使得低浓度的血型特异性抗体亚型也能够被有效检测到，为了优化抗原a的制备过程，采用木瓜蛋白酶的pbs溶液进行恒温消化是一种有效的手段，这一步骤确保了红细胞的充分消化，从而获得高质量的抗原a，为后续的特异性结合和灵敏度提升提供了保障。

27、优选的，活化所述微球的方法为：将微球超声分散至mes缓冲液中，再与3-5mg/ml的edc水溶液进行混合，涡旋进行活化20-40min。

28、通过采用上述技术方案：通过超声分散技术，微球能够在mes缓冲液中实现均匀、细致的分散，这种均匀分散确保了微球与后续加入的edc水溶液能够进行充分、均匀的接触，从而有效促进活化反应的进行，活化过程中，edc作为活化剂能够与微球进行高效结合，这一步骤对于提升检测试剂的灵敏度和特异性至关重要，此外，整个活化过程简便易行，只需将微球、mes缓冲液和edc水溶液进行混合，并通过涡旋实现均匀混合，无需复杂的化学反应或特殊设备，这种简便的操作进一步突出了该方法的实用性和高效性。

29、综上所述，本技术具有以下有益技术效果：

30、本技术提供的这种检测盒，包括圆底微孔板和显色体试剂，主要用于血型特异性抗体分型检测。这种检测盒在制备的过程中，在微球上标记有不同亚型的抗人igg亚型抗体，在圆底微孔板的微孔内包被红细胞膜抗原，当检测样本中含有血型特异性抗体亚型，就会在微孔内形成微球-抗人igg亚型抗体-血型特异性抗体-红细胞抗原复合物，经过适宜的转速离心后，微球会平铺在微孔内，若待测样本中不含血型特异性抗体亚型，则微球会在离心力的作用下汇聚在微孔的底部，由于微球具有不同的颜色，只需观察微孔板底部的状态以及颜色变化即可对样本中的血型特异性抗体亚型实现半定量检测。

31、因此，相较于现有的血型特异性抗体分型检测只能检测总igg，无法对特异性igg进行分型，本技术提供的这种检测试剂盒，操作简单，只需使用离心机，凭借肉眼即可观测结果检测成本低，对检测人员的专业性要求低，且灵敏度和特异性均良好，响应度高，能够实现对特异性igg进行分型检测。