粘性生物样本前处理液及其制备方法和用途与流程

本技术涉及细胞涂片病理检测，尤其是涉及一种粘性生物样本前处理液及其制备方法和用途。

背景技术：

1、痰液，是呼吸道受到刺激分泌的液体，其包含粘液、异物、病原微生物，各种炎症细胞、坏死脱落的粘膜上皮细胞等复杂成分，临床上，可以针对病人的痰液进行检测，用于辅助诊断治疗。痰液的粘稠度主要是与痰中的酸性糖蛋白有关，由于糖蛋白分子依靠不同的键(如二硫键、氢键等)交叉联接在一起，形成一种凝胶网。且痰液含有电解质，可以增加粘稠度。呼吸道感染时，由于大量炎症细胞的核破坏而产生的dna亦使痰液的粘稠度显著提高，形成所谓脓痰。

2、痰液标本的制片方法主要以涂抹法为主，使用棉签选取血丝、灰白色痰丝等可能含有待检成分的部分，以涂抹法进行制片操作。

3、然而，若对痰液样本缺乏必要的前处理，后续检测中会存在以下问题：a、原涂抹制片法的特点，制片时主观意向明显，制片采取的标本量较少，存在较大的漏检的风险；b、涂片后细胞粘贴在载玻片上不够牢固，固定时易冲散，标本制片污染率高；c、细胞量较少，单位面积内的细胞含量较少，厚薄不均，对镜下诊断造成困难；d、涂抹不均匀影响后续诊断阅片效果、诊断医生阅片面积过大，诊断耗时较长。

4、在此基础上，也有一些针对痰液样本前处理的方案，如以二硫苏糖醇、n-乙酰半胱氨酸、l-半胱氨酸、s-(羧甲基)-l-半胱氨酸、胰蛋白酶、硫代乙醇酸铵、硫代乙醇酸钠、2-巯基乙烷磺酸钠等粘液消化剂对样本进行处理，能够快速液化痰液，降低了痰液粘稠，易于涂片、薄层液基以及镜检观察，以使痰液中待检目标生物体(例如细胞、真菌、病原微生物等)从大分子粘液物质中游离出来，进而使待检目标物更容易被收集，提高了采样质量和检测阳性率。

5、然而，经过此类前处理所得到的痰液制片，仍存在较多的粘液、异物等，有效脱落上皮细胞含量较少，导致检测准确度不高，且常规粘液消化剂存在成本高、配制复杂等问题。

技术实现思路

1、针对上述常规粘性样本前处理后杂细胞多，处理试剂成本高等问题，本发明提供一种粘性生物样本前处理液，采用该前处理液对粘液样本处理后，可以除去粘液干扰，使上皮细胞等脱落细胞充分裸露，脱落细胞更加聚集，从而使镜下细胞以单一形式存在，均匀分布，便于观察，提高检出标本阳性率。

2、一方面，本发明公开了一种粘性生物样本前处理液，包含：乙酸，水溶性强酸铵盐和醇类溶剂。

3、本发明人在前期研究中发现，常规方法中对粘液样本进行前处理，主要是加入特定物质，例如胰蛋白酶、koh、氯化钠和乙醇等，以破坏痰液中漏出的血细胞或分泌细胞分泌出的粘液物质，以期使痰液中待检的脱落上皮细胞从大分子粘液物质中游离出来，进而使待检目标物更容易被收集。然而，这些大分子粘液物质被破坏而带来待检目标物被更容易收集的同时，势必也会使痰液样品所含的一些如血细胞、验证细胞等的无诊断意义细胞也更容易游离。

4、发明人在实验中偶然发现，由乙酸、酒精、氯化铵所组成的处理液能够有效降低粘液生物样本的粘度，在处理后结果标本细胞裸露较为充分，细胞分布均匀，且固定效果良好，特别是在脱落细胞病理诊断中，该处理液一方面可通过溶胀红细胞使其形态变化或利用乙酸裂解破坏红细胞，使其在阅片时镜下视野内与有效细胞易于区分。

5、并且，上述由乙酸等试剂提供酸性环境，相比于其它盐酸等强酸提供的相同ph酸性环境，本发明的前处理液能提供缓冲的酸性环境，即在氢离子被消耗后乙酸会缓慢释放氢离子，以维持酸性环境的相对稳定性，从而保持相对的稳定性，避免微环境剧烈变化致使细胞破损。且其中乙醇既可以作为助溶剂，提高粘液样本在前处理液中的分散性，也可作为固定剂使用，用于固定细胞形态，保持细胞相对稳定性。

6、在其中一些方案中，所述乙酸，水溶性强酸铵盐和醇类溶剂的用量比为10-20ml:1g:60-85ml，优选14-18ml:1g:65-79ml，更优选16ml:1g:72ml。

7、可以理解，上述乙酸用量指冰醋酸液体用量，实际操作中，也可配制为溶液使用，仅需按其中乙酸浓度折算用量即可。

8、在其中一些方案中，所述水溶性强酸铵盐为氯化铵，和/或，所述醇类溶剂为乙醇。

9、该前处理液还包括水，所述水与所述水溶性强酸铵盐的用量比为80-105ml:1g，优选83-101ml:1g，更优选92ml:1g。

10、在其中一些方案中，所述粘性生物样本前处理液的ph为5.5-6.0。

11、另一方面，本发明公开了上述的粘性生物样本前处理液的制备方法，包括以下步骤：

12、a液配制：将乙酸倒入醇类溶剂水溶液中，得a液，备用；

13、b液配制：将所述水溶性强酸铵盐溶于水中，得到水溶性强酸铵盐的水溶液，得b液，备用；

14、前处理液配制：将所述a液和b液混合均匀，即得。

15、另一方面，本发明公开了一种粘性生物样本的前处理方法，包括以下步骤：取粘性生物样本，加入上述的粘性生物样本前处理液，充分接触反应。

16、在其中一些方案中，所述粘性生物样本为痰液，和/或，所述粘性生物样本前处理后用于脱落细胞病理检测。

17、本领域知晓，脱落细胞学属于细胞病理学的一个分支，是采集人体各部位的自然脱落细胞，经染色后用显微镜观察其形态，通过检查细胞的形态结构，进行健康和疾病的筛查、诊断和研究，即对无症状个体进行癌前病变的筛检，对有症状或有体征患者进行诊断和鉴别诊断。由于恶性肿瘤的组织细胞之间粘合力下降，加上常有出血坏死等情况，致使肿瘤细胞更易脱落。这是脱落细胞学用以临床诊断的理论依据。如痰液、尿液细胞学检查，可分别查到呼吸道、泌尿道肿瘤细胞，子宫颈刮片可查见宫颈恶性瘤细胞。细胞病理学的基本步骤包括标本采集、涂片制备、标本固定、标木浓缩、染色、镜检等。制片的目的是将采集的细胞成分置于载玻片上，以便染色后进行镜下检查诊断。因此，痰液由于其通常形状粘稠，在制片过程中存在难度，未经处理的痰液涂片后镜下见脱落细胞不均匀散落在大量片状或网状黏液类物质中，黏液会遮挡脱落细胞不便于细胞观察，对诊断在成干扰和困难。因而，使用上述粘性生物样本前处理液对痰液样本进行前处理，有利于后续诊断。

18、在其中一些方案中，所述粘性生物样本与所述前处理液的用量比为1-4ml:5ml，优选2-3ml:5ml。

19、在其中一些方案中，所述接触反应的条件为：在15-40℃下振荡20s-240s，优选在25-35℃下振荡60s-180s。

20、上述水溶性强酸铵盐可以选自氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、溴化铵、碳酸铵等。

21、上述醇类溶剂可以选自异丙醇、乙醇或甲醇等。

22、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

23、本发明所用试剂和原料均市售可得。

24、本发明的积极进步效果在于：

25、本发明的一种粘性生物样本前处理液，由乙酸、水溶性强酸铵盐和醇类溶剂组成，对粘性痰液处理后结果标本细胞充分裸露，脱落细胞更加聚集，且固定效果良好，大幅度减少了细胞退化及损伤的情况，阅片时镜下每个视野内都布满有效细胞。既具有粘液成分去除效果好的优势，同时又保持了其它各类的细胞组分的完整性。

26、并且，经本发明的前处理液处理的样本，一方面可有效去除粘液干扰，使脱落细胞充分暴露，另一方面还可使红细胞溶胀变形或裂解，去除红细胞后更易于区分上皮细胞，使得标本诊断准确率提高。