一种牛奶组分过敏原特异性IgE检测试剂盒及其方法

本发明涉及检测试剂盒，具体涉及一种牛奶组分过敏原特异性ige检测试剂盒及其方法。

背景技术：

1、食物过敏是当今重大的卫生学问题，对人们的身体健康、生活质量造成严重的影响，对食物过敏的致病机理、检测、防治的研究日益受到重视。牛奶过敏是食物过敏中的主要类型之一，在婴幼儿中高发，严重威胁患儿的健康和生长发育。牛奶是人类脂肪、蛋白质和微量营养素的最佳来源，也被认为是引起90％个体过敏的八组食物之一。过敏人群会出现皮肤瘙痒、红色皮疹、恶心、呕吐、腹泻、腹痛，以及急性呼吸等反应，严重者可导致死亡。各地发病率从1％到7.5％不等。在对中国的食物过敏儿童的研究中发现，牛奶过敏在自我报告型过敏原中排名第三，患病率约10.8％。大多数牛奶过敏的患者在3岁-5岁会产生耐受，不再受到牛奶过敏的困扰，然而仍有15％-20％的患者对牛奶过敏会持续更久。

2、牛奶过敏原主要包括α-乳白蛋白(bos d 4)、β-乳球蛋白(bos d 5)、牛血清白蛋白(bos d 6)、酪蛋白(bos d 8)。目前，牛奶过敏原存在的主要问题是天然提取的原料抗原表位被掩盖，导致标记后的过敏原与ige结合能力降低，过敏患者对牛乳蛋白的ige反应活性具有很大的可变性，并且并不能确定导致牛乳致敏性是单一过敏原引起，还是多个过敏原共同引起。

3、及早检测和确诊食物过敏，是该疾病防控的关键。食物过敏的致病机理主要为i型超敏反应，机体对某种食物过敏时，会在体内产生特异性抗体(主要为ige型)，能特异性结合食物中导致过敏的成分—过敏原。尽管关于食物过敏的诊断已有大量研究，但如何精准识别过敏原一直是困扰临床的重要问题。过敏原组分解析诊断可同时检测多种食物蛋白的组分特异性ige(sige)，使临床对食物过敏患者的管理更加精准。

4、目前，牛奶的体内过敏诊断和过敏原特异性免疫治疗主要是依靠天然的牛奶提取物。然而，牛奶提取物中包含了致敏成分和非致敏成分，可能引起交叉反应而导致诊断不准确；且无法明确对患者致敏的具体过敏原组分；更不能定量地反应过敏原组分的特异性ige水平。

5、免疫磁珠(简称磁珠)具有操作简便、分离效率高、较大的比表面积及良好的物理稳定性的优点，是一种性能优良的磁性分离载体，且是纯化、检测和定量分析复杂分析物的通用工具。在外加磁场的作用下，能够快速与底物液相分离，磁珠以其高效分离和富集作用在免疫分析反应中使抗原对磁珠上固定化抗体的影响显著降低。磁珠作为整个免疫反应和信号收集的载体具有显著优越性，磁珠比表面积大，能结合更多的蛋白分子；磁珠表面化学基团与蛋白形成共价偶联，相对于物理吸附更牢固，更稳定；磁珠均匀悬浮于反应溶液中，大大增加与样本中待测物接触面积，减少反应所需的样本量，同时更快达到反应动态平衡，加快反应速度，节省反应时间。磁珠结构一般由磁性内核、包裹在外的高分子涂层及功能基层构成。高分子涂层材料一般为聚苯乙烯、聚氯乙烯，主要用于稳定新形成的磁珠表面和防止磁珠聚集。但高分子涂层可以与多种活性物质结合，如抗原、抗体等。bsa、酪蛋白等动物来源的蛋白质常作为封闭剂，阻断磁珠本身与样本中的非特异性吸附。但是在牛奶过敏原检测中，bsa和酪蛋白是牛乳主要过敏原，在检测中采用bsa和酪蛋白对磁珠进行封闭，会导致漏检等问题出现。

6、对此，牛奶过敏原存在的主要问题是天然提取的原料抗原表位易被掩盖，导致生物素标记后的过敏原与ige结合能力降低，过敏患者对牛乳蛋白的ige反应活性具有很大的可变性，并且并不能确定导致牛乳致敏性是单一过敏原引起，还是多个过敏原共同引起。单纯使用过敏原组分组合会导致漏检，如专利cn 112748248a仅使用单独的α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、记α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，这些蛋白仅是天然的或者重组的均无法满足在临床的检测要求，天然提取蛋白会结合大量牛奶中其他物质，而导致与ige结合表位被掩盖，仅使用重组蛋白而因其无天然蛋白的高级结构，这些均会导致漏检。

7、在磁珠包被过程中，bsa、酪蛋白等动物来源的蛋白质常作为封闭剂，来阻断磁珠本身与样本中的非特异性吸附。但是在牛奶过敏原检测中，bsa和酪蛋白是牛乳主要过敏原，在检测中采用bsa和酪蛋白对磁珠进行封闭，会导致漏检或干扰等问题出现。

8、此外，常用的免疫分析缓冲液buffer中均含有哺乳动物源性成分(牛、马、羊等血清或者bsa等)，这些成分中牛的血清和牛血清白蛋白会造成严重的检测干扰，如cn112748248 a采用5％的马血清进行试剂配制，这会因交叉反应导致漏检。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种牛奶组分过敏原特异性ige检测试剂盒及其方法，解决了天然提取的牛奶过敏原表位被掩盖，导致标记后的过敏原与ige结合能力降低，过敏患者对牛乳蛋白的ige反应活性具有很大的可变性，并且并不能确定导致牛乳致敏性是单一过敏原引起，还是多个过敏原共同引起的漏检；以及磁珠包被过程和采用缓冲剂因含有蛋白质造成检测干扰导致的漏检或干扰问题。

2、本发明通过下述技术方案实现：

3、本发明一方面提供一种牛奶组分过敏原特异性ige检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：链霉亲和素包被的磁微粒、生物素标记的牛奶组分过敏原、碱性磷酸酶标记的鼠抗人ige抗体、校准品、生物素标记的鼠抗人ige抗体；

4、其中，生物素标记的牛奶组分过敏原包括：生物素标记α-乳清蛋白、生物素标记β-乳球蛋白、生物素标记牛血清白蛋白、生物素标记酪蛋白和生物素标记重组β-乳球蛋白。

5、进一步地，在所述的牛奶组分过敏原特异性ige检测试剂盒中，所述α-乳清蛋白为α-亚麻酸诱导处理α-乳清蛋白；

6、和/或，所述α-亚麻酸诱导处理α-乳清蛋白的制备包括：将α-乳白蛋白和α-亚麻酸按照摩尔比1:50混匀后，在温度30～60℃反应10～30min，经离心透析获得所述α-亚麻酸诱导处理α-乳清蛋白。

7、进一步地，在所述的牛奶组分过敏原特异性ige检测试剂盒中，所述β-乳球蛋白为超声波处理β-乳球蛋白；

8、和/或，所述超声波处理β-乳球蛋白的制备包括：

9、在低于15℃温度下，将β-乳球蛋白以100～150w/cm2功率，超声处理10～40min。

10、进一步地，在所述的牛奶组分过敏原特异性ige检测试剂盒中，所述重组β-乳球蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。

11、进一步地，在所述的牛奶组分过敏原特异性ige检测试剂盒中，所述链霉亲和素包被的磁微粒的浓度为1～10μg/ml；

12、和/或，所述生物素标记的牛奶组分过敏原的浓度为0.1～1μg/ml；

13、和/或，所述碱性磷酸酶标记的鼠抗人ige抗体的浓度为0.1～1μg/ml；

14、和/或，所述生物素标记的鼠抗人ige抗体的浓度为0.1～1μg/ml。

15、进一步地，在所述的牛奶组分过敏原特异性ige检测试剂盒中，所述链霉亲和素包被的磁微粒采用0.1～5％ db1130、0.1～1％吐温-20和100-200mm nacl、ph＝7-8的tris-hcl缓冲液配制成悬浮液。

16、进一步地，在所述的牛奶组分过敏原特异性ige检测试剂盒中，所述碱性磷酸酶标记的鼠抗人ige抗体包括采用含1％鱼血清、ph＝6-7的mes缓冲液配置成溶液。

17、进一步地，在所述的牛奶组分过敏原特异性ige检测试剂盒中，所述生物素标记的鼠抗人ige抗体的制备包括：

18、将生物素与鼠抗人ige抗体混合，避光反应10～60min，加入0.1～5％tris封闭，采用浓度为ph＝7-8，0.1～1m磷酸盐缓冲液配制成溶液；

19、和/或，所述生物素为bnhs-biotin。

20、进一步地，在所述的牛奶组分过敏原特异性ige检测试剂盒中，所述生物素标记的牛奶组分过敏原的制备包括：

21、将生物素与牛奶组分过敏原混合，避光反应10～60min，加入0.1～5％tris封闭，采用浓度为ph＝7-8，0.1～1m磷酸盐缓冲液配制成溶液；

22、和/或，所述生物素为bnhs-biotin。

23、本发明第二方面提供一种牛奶组分过敏原特异性ige检测方法，基于所述的牛奶组分过敏原特异性ige检测试剂盒，所述检测方法包括：

24、将待测样本与链霉亲和素包被的磁微粒悬浮液和生物素标记的牛奶组分过敏原混匀并在30～40℃孵育1-30min；

25、经洗涤后，加入碱性磷酸酶标记的鼠抗人ige抗体反应1～30min，形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物；经洗涤后，加入发光底物，测定化学发光强度。

26、本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

27、1、本发明提供的牛奶组分过敏原特异性ige检测试剂盒及其方法，将天然提取蛋白和重组蛋白结合，并对天然提取蛋白进行预先处理后进行标记，制备的牛奶过敏源检测试剂盒可以同时快速检测被测者对牛奶4种组分过敏情况，且能分析其对每一组分的具体致敏等级，可以解决患者检测牛奶过敏原不明晰，盲目拒食等的问题。

28、2、本发明提供的牛奶组分过敏原特异性ige检测试剂盒及其方法，通过对天然提取α-乳清蛋白采用α-亚麻酸诱导以改变蛋白结构，暴露出更多与ige的结合位点，提高其与特异性ige的结合能力；对天然提取β-乳球蛋白用超声波处理提高其抗原性；将天然蛋白和重组蛋白相结合，模拟在体内消化后的抗原表位，提升致敏性，提高检测准确性。

29、3、本发明提供的牛奶组分过敏原特异性ige检测试剂盒及其方法，使用非动物源性封闭剂，可以有效避免动物源性成分造成的干扰，使检测结果更准确可靠。