本发明涉及临床检测，具体涉及一种免疫球蛋白g4亚型检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
1、免疫球蛋白g4亚型(igg4)是机体淋巴组织浆细胞合成分泌形成的一种球蛋白，在血液中升高代表身体有免疫性疾病或抗体生成紊乱问题，是慢性、系统性、自身炎症性疾病的指示指标，该类疾病主要累及胰腺、肝胆、肾脏等脏器，比如存在间质性肺炎、系统性红斑狼疮或多发性骨髓瘤等疾病；若其浓度降低则表示发生一型糖尿病、青少年糖尿病、肾病综合征和艾滋病等。因此免疫球蛋白g4亚型的检测对临床诊断能够提供重要依据。
2、目前测定血清免疫球蛋白g4亚型的方法主要有酶联免疫法、单向免疫扩散法、免疫比浊法。酶联免疫法需要手工操作，检测时间都在1小时以上，极难在临床上大量应用；单向免疫扩散法操作繁琐复杂，检测时间更长，一般需要5h以上，不能及时得到检测结果；免疫比浊法操作简单，所需时间短，但易受待检样品中物质干扰，如乳糜、胆红素等。
3、因此需要开发一种能够消除乳糜、胆红素、血红蛋白、类风湿因子干扰的免疫球蛋白g4亚型检测试剂盒及其制备方法。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供一种免疫球蛋白g4亚型检测试剂盒及其制备方法，通过在试剂盒中设置样品预处理滤膜，将待检样品中的乳糜、胆红素、血红蛋白、类风湿因子等干扰物部分去除，提高检测试剂盒的抗干扰性能，从而增加检测准确性和稳定性。
2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供一种免疫球蛋白g4亚型检测试剂盒，所述免疫球蛋白g4亚型检测试剂盒包括第一试剂、样品预处理滤膜、第二试剂和第三试剂；
4、所述第一试剂包括抗第一防腐剂、第一ph调节剂、还原剂、第一蛋白稳定剂、三羟甲基氨基甲烷；
5、所述第一防腐剂为叠氮钠，质量浓度0.05％-0.11％；所述第一ph调节剂为磷酸盐缓冲液，浓度为50-70mmol/l；所述还原剂为半胱氨酸、维生素c、还原型谷胱甘肽中的一种，浓度为5-28mmol/l；所述第一蛋白稳定剂为甘露醇，质量浓度为0.9％-1.7％；所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为30-90mmol/l；
6、所述样品预处理滤膜由第一滤层、第二滤层、第三滤层组成；
7、所述第一滤层为聚酰亚胺纤维滤膜，厚度为5-20微米；所述第二滤层为聚乙烯醇纤维滤膜，厚度为10-30微米，偶联有羟基酸柔性臂，所述羟基酸柔性臂的自由端偶联单酯化柠檬酸；所述第三滤层为聚丙烯醇纤维滤膜，厚度为5-10微米，偶联有短链二元酸柔性臂，所述短链二元酸柔性臂的自由端偶联fc片段标签，所述fc片段标签的氨基酸序列为gly-thr-ser-glu-lys-pro-leu-cys-cys-lys-ile-ile-leu-val-leu-glu-arg；所述样品预处理滤膜的第一滤层、第二滤层、第三滤层依顺序压合，所述第一滤层首先接触待处理样品；
8、所述第二试剂包括第二防腐剂、第二ph缓冲剂、解吸剂；
9、所述第二防腐剂为proclin300，质量浓度为0.1％-0.3％；所述第二ph缓冲剂为醋酸盐缓冲液，浓度为30-60mmol/l；所述解吸剂为1，4丁二醇，质量浓度为0.5％-1.1％；
10、所述第三试剂包括第三防腐剂、第三ph调节剂、负载免疫球蛋白g4亚型抗体的胶乳微球、第二蛋白蛋白稳定剂；
11、所述第三防腐剂为叠氮钠，质量浓度为0.1％-0.19％；所述第三ph调节剂为甘氨酸钠缓冲液，浓度为70-120mmol/l；所述负载免疫球蛋白g4亚型抗体的胶乳微球的质量浓度为9-16g/l；所述第二蛋白稳定剂为精氨酸和木寡糖，所述精氨酸的质量浓度为0.3％-0.5％，所述木寡糖质量浓度为0.9％-1.2％；
12、所述第一试剂的ph为6.1-6.3、第二试剂的ph为7.15-7.55，第三试剂的ph为7.3-7.7，使用氢氧化钠或盐酸调节。
13、优选地，所述样品预处理滤膜的孔径为4.5-16微米。
14、优选地，所述羟基酸柔性臂的羟基酸包括γ-羟基丁酸、δ-羟基戊酸中的一种，所述短链二元酸柔性臂的短链二元酸包括丁二酸、戊二酸、己二酸中的一种，所述短链二元酸为羧基在分子两端的二元酸。
15、优选地，所述第二蛋白稳定剂的木寡糖包括含有5-8个木糖残基的木寡糖。
16、优选地，所述负载免疫球蛋白g4亚型抗体的胶乳微球包括羧基聚苯乙烯胶乳微球。
17、第二方面，本发明提供一种如上所述免疫球蛋白g4亚型检测试剂盒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
18、配制第一试剂：根据需要配制第一试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料，所述叠氮钠质量浓度0.05％-0.11％，所述磷酸盐缓冲液浓度50-70mmol/l，所述半胱氨酸、或维生素c、或还原型谷胱甘肽浓度5-28mmol/l，所述甘露醇质量浓度0.9％-1.7％，所述三羟甲基氨基甲烷浓度30-90mmol/l，溶解于相应体积的去离子水中，用盐酸或氢氧化钠溶液将ph值调节到6.1-6.3，得到所述第一试剂；
19、制备样品预处理滤膜：采用静电纺丝设备将聚酰亚胺加工成所述聚酰亚胺纤维滤膜，所述静电纺丝设备的喷头连接正极，所述静电纺丝设备的正极和负极间的电压为60-70kv，所述聚酰亚胺纤维的直径为2-5微米，所述聚酰亚胺纤维滤膜的厚度为5-20微米，得到第一滤层；
20、采用静电纺丝设备将聚乙烯醇加工成所述聚乙烯醇纤维滤膜，所述静电纺丝设备的喷头连接正极，所述静电纺丝设备的正极和负极间的电压为65-80kv，所述聚乙烯醇纤维的直径为0.5-1微米，所述聚乙烯醇纤维滤膜的厚度为10-30微米，将所述聚乙烯醇纤维滤膜与羟基酸溶液混合，使所述羟基酸的羧基与所述聚乙烯醇纤维滤膜上的羟基反应形成酯键，反应完成后过滤，洗涤，得到偶联羟基酸柔性臂的聚乙烯醇纤维滤膜，将所述偶联羟基酸柔性臂的聚乙烯醇纤维滤膜浸于磷酸缓冲液中，加入柠檬酸，使所述羟基酸柔性臂的羟基与所述柠檬酸的羧基形成酯键，得到所述第二滤层；
21、采用静电纺丝设备将聚丙烯醇加工成所述聚丙烯醇纤维滤膜，所述静电纺丝设备的喷头连接正极，所述静电纺丝设备的正极和负极间的电压为75-90kv，所述聚丙烯醇纤维的直径为0.8-3微米，所述聚乙烯醇纤维滤膜的厚度为5-10微米，将所述聚丙烯醇纤维滤膜与短链二元酸溶液混合，使所述短链二元酸的一端羧基与所述聚丙烯醇纤维滤膜上的羟基反应形成酯键，反应完成后过滤，洗涤，得到偶联短链二元酸柔性臂的聚丙烯醇纤维滤膜，将所述偶联短链二元酸柔性臂的聚丙烯醇纤维滤膜浸于磷酸缓冲液中，并加入活化剂nhs-edc，搅拌均匀，加入一定量吗啉，加入所述fc片段标签，搅拌均匀后孵育一定时间，使所述短链二元酸柔性臂的另一端羧基连接所述fc片段标签，得到所述第三滤层；
22、将所述第一滤层、第二滤层和第三滤层依次叠放，使用超声焊接装置，在超声振动的作用下使相邻纤维粘接，得到所述样品预处理滤膜；
23、配制第二试剂：根据需要配制第二试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料，所述proclin300质量浓度0.1％-0.3％，所述醋酸盐缓冲液浓度30-60mmol/l，所述1，4丁二醇质量浓度0.5％-1.1％，溶解于相应体积的去离子水中，用盐酸或氢氧化钠溶液将ph值调节到7.15-7.55，得到所述第二试剂；
24、配制第三试剂：根据需要配制第三试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料，所述叠氮钠质量浓度0.1％-0.19％，所述甘氨酸钠缓冲液浓度70-120mmol/l，所述负载免疫球蛋白g4亚型抗体的胶乳微球的质量浓度9-16g/l，所述精氨酸质量浓度0.3％-0.5％，所述木寡糖质量浓度0.9％-1.2％，溶解于相应体积的去离子水中，用盐酸或氢氧化钠溶液将ph值调节到7.3-7.7，得到所述第三试剂。
25、优选地，所述制备第二滤层的羟基酸溶液的浓度为1.2-3.5g/l，所述制备第二滤层的磷酸缓冲液的浓度为50-90mmol/l，所述柠檬酸在所述磷酸缓冲液中的浓度为8-16g/l。
26、优选地，所述制备第三滤层的磷酸缓冲液浓度为80-110mmol/l，nhs-edc的浓度为0.08-0.22g/l，所述fc片段标签的浓度为830-980mg/l，所述短链二元酸的浓度为4.2-6.8g/l。
27、优选地，所述胶乳微球的直径为100-150nm。
28、优选地，制备所述负载免疫球蛋白g4亚型抗体的胶乳微球，将胶乳微球加入mes·h2o 3-5.2g/l，使用氢氧化钠调节ph至6.9-7.1的缓冲液中，混合均匀后加入硼酸1.9-2.7g/l、磷酸氢二钠0.5-1.4g/l，使用氢氧化钠调节ph为7.2-7.6的缓冲液，在30-35℃下混合，得到胶乳微球悬浊液；然后将所述免疫球蛋白g4亚型抗体加入所述胶乳微球悬浊液中，所述免疫球蛋白g4亚型抗体在反应体系中的浓度为960-1270mg/l，再加入0.1-0.18g/l的edc·hci溶液和0.43-0.81g/l的nhs溶液，在35-38℃下搅拌进行偶联反应，反应时间为5-7h；加入由吐温110-150ml/l和bsa0.9-1.3g/l的封闭液，在26-30℃下搅拌分散，进行5-9h封闭反应；加入proclin300，使其在体系中浓度达到0.25-0.45ml/l，并使用氢氧化钠溶液或者盐酸将ph调节到6.8-7.3，搅拌浸泡14-16h，得到所述负载免疫球蛋白g4亚型抗体的胶乳微球。
29、相对于现有技术，本发明具有以下有益技术效果：①在试剂盒中设置具有三个滤层的样品预处理滤膜，第一滤层将待检样品中的乳糜吸附去除，吸附到第一滤层的乳糜进一步将样品中胆红素溶解脱除，第二滤层可以螯合血红蛋白中的亚铁离子，从而将血红蛋白部分去除，第三滤层偶联有fc片段标签，可特异性地与待检样品中的类风湿因子结合，因此提高了检测试剂盒的抗干扰性能，从而增加检测准确性和稳定性；②因消除了干扰物，使免疫球蛋白g4亚型与其偶联在胶乳微球上的相对应抗体反应速度更快，节省样本测定时间50％以上。