野生与养殖鲢的氨基酸类生物标志物及应用的制作方法

本技术涉及鲢判定或确证，具体涉及野生与养殖鲢的氨基酸类生物标志物及应用。

背景技术：

1、鲢(hypophthalmichthys molitrix)是我国重要的养殖品种，主要分布于长江流域。由于水域污染、过度捕捞等影响，长江流域的鱼类生物多样性在不断降低，因此我国从2020年起已全面实施“长江十年禁渔”决策，严厉打击长江流域非法捕捞与市场销售长江捕捞渔获物的违法行为。但是，由于目前国内长江流域野生与养殖水产品难以甄别，进而难以满足“长江禁捕”政策的要求。因此，研发野生与养殖水产品的判别与确证技术，挖掘判别野生与养殖鲢的标志物，并推广应用，是支撑“长江禁捕”政策的可靠手段。

技术实现思路

1、本技术针对野生与养殖鲢生物学性状接近、甄别技术缺乏的问题，首次采用超高通量液相色谱－质谱联用技术，收集了不同的野生与养殖鲢群体的肌肉样本，进行了代谢组学分析，探讨了野生与养殖鲢代谢物的共性差异及变化，筛选出了氨基酸类的生物标志物：脯氨酸(cas：609-36-9)、缬氨酸(cas：7004-03-7)、亮氨酸(cas：3588-60-1)、nε-甲酰基-l-赖氨酸(cas：1190-48-3)、γ-氨基丁酸(cas：56-12-2)、n-甲酰甘氨酸(cas：2491-15-8)、n-乙酰-l-赖氨酸(cas：1946-82-3)、肌酐(cas：60-27-5)、dl-2-氨基辛酸(cas：644-90-6)、5-氨基乙酰丙酸(cas：106-60-5)。利用液相色谱-质谱联用检测的结果，进行统计和逻辑回归分析，得到逻辑回归分析模型，根据逻辑回归模型判断受试样本的来源，能够准确判别野生与养殖性，具有较好的敏感度和特异度。并且，本技术提供的生物标志物及用途能够为相关执法部门提供科学依据和技术支撑，加强长江流域非法捕捞行为的监管和打击力度，减少对野生资源的过度捕捞，进而为更好地管理和保护鲢资源提供技术基础。

2、为此，本技术实施例至少公开了以下技术方案：

3、第一方面，实施例公开了生物标志物，其含有脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、nε-甲酰基-l-赖氨酸、γ-氨基丁酸、n-甲酰甘氨酸、n-乙酰-l-赖氨酸、肌酐、dl-2-氨基辛酸、5-氨基乙酰丙酸中的至少一种。

4、在第一方面的实施例中，所述生物标志物包含为脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、nε-甲酰基-l-赖氨酸、γ-氨基丁酸、n-甲酰甘氨酸、n-乙酰-l-赖氨酸、肌酐、dl-2-氨基辛酸、5-氨基乙酰丙酸中的至少一种。

5、在第一方面的实施例中，所述生物标志物包含脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸中的至少一种。

6、在第一方面的实施例中，所述生物标志物包含nε-甲酰基-l-赖氨酸、γ-氨基丁酸、n-甲酰甘氨酸、n-乙酰-l-赖氨酸、肌酐中的至少一种。

7、在第一方面的实施例中，所述生物标志物包含dl-2-氨基辛酸、5-氨基乙酰丙酸中的至少一种。

8、第二方面，实施例公开了用于判别野生鲢与养殖鲢的生物标志物，其含有为脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、nε-甲酰基-l-赖氨酸、γ-氨基丁酸、n-甲酰甘氨酸、n-乙酰-l-赖氨酸、肌酐、dl-2-氨基辛酸、5-氨基乙酰丙酸中的至少一种。

9、在第二方面的实施例中，所述生物标志物包含为脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、nε-甲酰基-l-赖氨酸、γ-氨基丁酸、n-甲酰甘氨酸、n-乙酰-l-赖氨酸、肌酐、dl-2-氨基辛酸、5-氨基乙酰丙酸。

10、第三方面，实施例公开了用于判别野生鲢与养殖鲢的生物标志物，其含有脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸中的至少一种。

11、在第三方面的实施例中，所述生物标志物包含脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸。

12、第四方面，实施例公开了用于判别野生鲢与养殖鲢的生物标志物，其含有nε-甲酰基-l-赖氨酸、γ-氨基丁酸、n-甲酰甘氨酸、n-乙酰-l-赖氨酸、肌酐中的至少一种。

13、在第四方面的实施例中，所述生物标志物包含nε-甲酰基-l-赖氨酸、γ-氨基丁酸、n-甲酰甘氨酸、n-乙酰-l-赖氨酸、肌酐。

14、第五方面，实施例公开了用于判别野生鲢与养殖鲢的生物标志物，其含有dl-2-氨基辛酸、5-氨基乙酰丙酸中的至少一种。

15、在第五方面的实施例中，所述生物标志物包含dl-2-氨基辛酸、5-氨基乙酰丙酸。

16、第六方面，实施例公开了试剂组合物，其包含用于检测第一至五方面任一所述生物标志物的试剂。

17、在第六方面的实施例中，所述试剂包含用于提取受试样本的代谢物的试剂。在一些实施例中，所述试剂包含钢珠和甲醇－水溶液(4：1，v/v)。

18、第七方面，实施例公开了第一至五方面任一所述的生物标志物和/或用于检测第一至五方面所述的生物标志物在判别野生与养殖鲢中的用途。

19、第八方面，实施例公开了判别野生鲢与养殖鲢的方法。

20、在第八方面的实施例中，所述方法包括测试受试样本中第二方面所述的生物标志物中各个生物标志物含量的方法。在一些实施例中，所述受试样本为鲢的上背部肌肉样本。在一些实施例中，所述各个生物标志物包括脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、nε-甲酰基-l-赖氨酸、γ-氨基丁酸、n-甲酰甘氨酸、n-乙酰-l-赖氨酸、肌酐、dl-2-氨基辛酸、5-氨基乙酰丙酸。

21、在第八方面的实施例中，所述方法还包括：获得第一逻辑回归模型和第一阈值；获得受试样本中多个生物标志物含量的多个标准化值；将多个所述标准化值输入所述第一逻辑回归模型得到第一野生概率；根据所述第一野生概率与所述第一阈值的大小确定所述受试样本为所述野生鲢或所述养殖鲢。在一些实施例中，所述第一逻辑回归模型为：x＝-23.428×a+38.212×b+28.738×c-63.957×d-124.040×e-57.712×f+50.106×g+47.266×h+15.842×i+9.120×j+665.268；第一野生概率＝1/(1+e－x)；其中a、b、c、d、e、f、g、h、i、j分别依次为脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、nε-甲酰基-l-赖氨酸、γ-氨基丁酸、n-甲酰甘氨酸、n-乙酰-l-赖氨酸、肌酐、dl-2-氨基辛酸、5-氨基乙酰丙酸的标准化值，所述第一野生概率表征受试样本为野生鲢的概率。在一些实施例中，若所述第一野生概率大于所述第一阈值，则受试样本为野生鲢。在一些实施例中，若所述第一野生概率小于所述第一阈值，则受试样本为养殖鲢。

22、在第八方面的实施例中，第一阈值的确定步骤包括：根据收集的肌肉样本的为脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、nε-甲酰基-l-赖氨酸、γ-氨基丁酸、n-甲酰甘氨酸、n-乙酰-l-赖氨酸、肌酐、dl-2-氨基辛酸、5-氨基乙酰丙酸的标准化值作为训练集；以该训练集训练二元逻辑回归模型，分别得到多个所述第一野生概率值；分别计算每一所述第一野生概率值的敏感性(真正例率)和1-特异性(假正例率)，将1-特异性作为横坐标和敏感性作为纵坐标来绘制roc曲线；计算每个第一野生概率对应的约登指数(约登指数＝敏感度+特异度-1)，并获得最大约登指数，所述最大约登指数对应的第一野生概率即为第一阈值。在一些实施例中，第一阈值为0.50。

23、第九方面，实施例公开了判别野生鲢与养殖鲢的方法。

24、在第九方面的实施例中，所述方法包括测试受试样本中第三方面所述的生物标志物中各个生物标志物含量的方法。在一些实施例中，所述受试样本为鲢的上背部肌肉样本。在一些实施例中，所述各个生物标志物包括脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸。

25、在第九方面的实施例中，所述方法还包括：获得第二逻辑回归模型和第二阈值；获得受试样本中多个生物标志物含量的多个标准化值；将多个所述标准化值输入所述第二逻辑回归模型得到第二野生概率；根据所述第二野生概率与所述第二阈值的大小确定所述受试样本为所述野生鲢或所述养殖鲢。在一些实施例中，所述第二逻辑回归模型为：x＝-5.711×a+8.571×b+3.255×c-31.835；第二野生概率＝1/(1+e－x)；其中a、b、c分别依次为脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸的标准化值，所述第二野生概率表征受试样本为野生鲢的概率。在一些实施例中，若所述第二野生概率大于所述第二阈值，则受试样本为野生鲢。在一些实施例中，若所述第二野生概率小于所述第二阈值，则受试样本为养殖鲢。

26、在第九方面的实施例中，第二阈值的确定步骤包括：根据收集的肌肉样本的脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸的标准化值作为训练集；以该训练集训练二元逻辑回归模型，分别得到多个所述第二野生概率值；分别计算每一所述第二野生概率值的敏感性(真正例率)和1-特异性(假正例率)，将1-特异性作为横坐标和敏感性作为纵坐标来绘制roc曲线；计算每个第二野生概率对应的约登指数(约登指数＝敏感度+特异度-1)，并获得最大约登指数，所述最大约登指数对应的第二野生概率即为第二阈值。在一些实施例中，第二阈值为0.544。

27、第十方面，实施例公开了判别野生鲢与养殖鲢的方法。

28、在第十方面的实施例中，所述方法包括测试受试样本中第四方面所述的生物标志物中各个生物标志物含量的方法。在一些实施例中，所述受试样本为鲢的上背部肌肉样本。在一些实施例中，所述各个生物标志物包括nε-甲酰基-l-赖氨酸、γ-氨基丁酸、n-甲酰甘氨酸、n-乙酰-l-赖氨酸、肌酐。

29、在第十方面的实施例中，所述方法还包括：获得第三逻辑回归模型和第三阈值；获得受试样本中多个生物标志物含量的多个标准化值；将多个所述标准化值输入所述第三逻辑回归模型得到第三野生概率；根据所述第三野生概率与所述第三阈值的大小确定所述受试样本为所述野生鲢或所述养殖鲢。在一些实施例中，所述第三逻辑回归模型为：x＝-673.687×a-367.827×b-570.700×c+568.811×d+345.444×e+5080.475；第三野生概率＝1/(1+e－x)；其中a、b、c、d、e分别依次为nε-甲酰基-l-赖氨酸、γ-氨基丁酸、n-甲酰甘氨酸、n-乙酰-l-赖氨酸、肌酐的标准化值，所述第三野生概率表征受试样本为野生鲢的概率。在一些实施例中，若所述第三野生概率大于所述第三阈值，则受试样本为野生鲢。在一些实施例中，若所述第三野生概率小于所述第三阈值，则受试样本为养殖鲢。

30、在第十方面的实施例中，第三阈值的确定步骤包括：根据收集的肌肉样本的nε-甲酰基-l-赖氨酸、γ-氨基丁酸、n-甲酰甘氨酸、n-乙酰-l-赖氨酸、肌酐的标准化值作为训练集；以该训练集训练二元逻辑回归模型，分别得到多个所述第三野生概率值；分别计算每一所述第三野生概率值的敏感性(真正例率)和1-特异性(假正例率)，将1-特异性作为横坐标和敏感性作为纵坐标来绘制roc曲线；计算每个第三野生概率对应的约登指数(约登指数＝敏感度+特异度-1)，并获得最大约登指数，所述最大约登指数对应的第三野生概率即为第三阈值。在一些实施例中，第三阈值为0.50。

31、第十一方面，实施例公开了判别野生鲢与养殖鲢的方法。

32、在第十一方面的实施例中，所述方法包括测试受试样本中第五方面所述的生物标志物中各个生物标志物含量的方法。在一些实施例中，所述受试样本为鲢的上背部肌肉样本。在一些实施例中，所述各个生物标志物包括dl-2-氨基辛酸、5-氨基乙酰丙酸。

33、在第十一方面的实施例中，所述方法还包括：获得第四逻辑回归模型和第四阈值；获得受试样本中多个生物标志物含量的多个标准化值；将多个所述标准化值输入所述第四逻辑回归模型得到第四野生概率；根据所述第四野生概率与所述第四阈值的大小确定所述受试样本为所述野生鲢或所述养殖鲢。在一些实施例中，所述第四逻辑回归模型为：x＝4.583×a-2.879×b-8.170；第四野生概率＝1/(1+e－x)；其中a、b分别依次为dl-2-氨基辛酸、5-氨基乙酰丙酸的标准化值，所述第四野生概率表征受试样本为野生鲢的概率。在一些实施例中，若所述第四野生概率大于所述第四阈值，则受试样本为野生鲢。在一些实施例中，若所述第四野生概率小于所述第四阈值，则受试样本为养殖鲢。

34、在第十一方面的实施例中，第四阈值的确定步骤包括：根据收集的肌肉样本的dl-2-氨基辛酸、5-氨基乙酰丙酸的标准化值作为训练集；以该训练集训练二元逻辑回归模型，分别得到多个所述第四野生概率值；分别计算每一所述第四野生概率值的敏感性(真正例率)和1-特异性(假正例率)，将1-特异性作为横坐标和敏感性作为纵坐标来绘制roc曲线；计算每个第四野生概率对应的约登指数(约登指数＝敏感度+特异度-1)，并获得最大约登指数，所述最大约登指数对应的第四野生概率即为第四阈值。在一些实施例中，第四阈值为0.356。

35、在第八至十一任一方面的实施例中，所述标准化值为将各标志物检测的色谱峰面积进行归一化处理和底数为10的对数转换得到的值。

36、在第八至十一任一方面的实施例中，所述方法还包括液相色谱质谱联用的方法。

37、在第八至十一任一方面的实施例中，该液相色谱的检测步骤中，采用shimadzu－lc30超高效液相色谱系统(uhplc)进行检测，使用acquityhss t3(2.1×100mm，1.8μm)(waters,milford,ma,usa)色谱柱，柱温40℃，色谱流动相a为0.1％甲酸水溶液，色谱流动相b为100％乙腈溶液，洗脱模式为梯度洗脱，洗脱时间为15分钟，流速为0.3ml/min，具体进样量为4μl。色谱梯度洗脱具体程序如下：0→2min，0％b；2－6min，b从0％线性变化至48％；6→10min，b从48％线性变化至100％；10→12min，b维持在100％；12→12.1min，b从100％线性变化至0％，12.1→15min，b维持在0％。

38、在第八至十一任一方面的实施例中，该质谱的检测步骤中，采用电喷雾电离(esi)进行正离子(+)和负离子(－)模式检测。经uplc分离后用qe plus质谱仪(thermoscientific)进行质谱分析，使用hesi源进行离子化，其离子化条件如下：喷雾电压为3.8kv(+)和3.2kv(－)；毛细管温度为320℃；探头加热器温度为350℃；鞘流气为30arbitraryunits；辅助气流为5arbitrary units；s－lens射频电平为50arbitrary units。

39、在第八至十一任一方面的实施例中，该质谱的检测步骤中，质谱采集时间为15min。母离子扫描范围为75～1050m/z；一级质谱分辨率为70,000@m/z 200；目标离子数为3e6；一级最大注入时间为100ms。二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描后触发采集10个最高强度母离子的二级质谱图谱，二级质谱分辨率为17,500@m/z 200；目标离子数为1e5，二级最大注入时间为50ms。

40、在第八至十一任一方面的实施例中，对所述液相色谱质谱联用得到的结果进行质量控制。该质量控制步骤包括：通过混合来自所有样本的上清液等分试样制备质量控制(qc)样本；根据qc样本的重叠碱基峰离子色谱图(bpc)评估数据的重复性和仪器的稳定性；使用空白样本的bpc测定残留物；使用所有样本的主成分分析(pca)评估仪器分析的可靠性和稳定性。

41、在第八至十一任一方面的实施例中，对所述液相色谱质谱联用得到的原始数据采用msdial软件进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。